1. Preparazione di terreni e reagenti
- Preparazione di 200x di acido L-ascorbico 2-fosfato
- Sciogliere 29 mg di acido L-ascorbico 2-fosfato per 5 mL di soluzione di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) e filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Conservare in aliquote sterili da 0,25 mL a -20 °C.
- Aggiungere 0,25 mL di aliquote di 200x acido L-ascorbico 2-fosfato a ogni 50 mL di terreno per fibroblasti (DMEM con 1% di L-glutammina e 10% di siero fetale bovino) il giorno richiesto, per una concentrazione finale di 0,1 mM di acido L-ascorbico 2-fosfato.
- Preparazione dei terreni di crescita dei cheratinociti
- L'isolamento e la coltura dei cheratinociti del carcinoma a cellule squamose (SCC) sono stati descritti in precedenza. In esso è descritta anche la preparazione dei terreni di crescita dei cheratinociti.
- In breve, preparare il supporto come segue:
300 mL di DMEM e 100 mL di F-12 di Ham integrati con il 10% di FBS
0,4 mg/mL di idrocortisone
5 mg/mL di insulina
10 ng/mL di EGF
5 mg/mL di transferrina
8,4 ng/mL di tossina del colera
13 ng/mL di liotironina
1x soluzione di penicillina-streptomicina
2. Costruzione in vitro di una matrice nativa derivata da fibroblasti in terreni integrati con acido L-ascorbico 2-fosfato
- Seminare 200.000 fibroblasti per pozzetto in piastre a 6 pozzetti (20.000 cellule/cm2) in terreni fibroblastici integrati con acido L-ascorbico 2-fosfato. Rialimentare ogni 2-3 giorni con 2-5 ml di terreno. (Nota: la frequenza e il volume di rialimentazione possono essere regolati in base alle esigenze individuali delle diverse cellule.)
- Alla fine delle 6 settimane si formerà uno spesso strato di cellule incorporate nella matrice extracellulare, visibile ad occhio nudo (Figura 1). Per rilasciare questo strato dalla piastra di coltura tissutale, raschiare delicatamente la circonferenza della matrice con una punta per micropipetta da 1 mL e quindi spingere i bordi della matrice verso il centro del pozzetto. Questo strato di cellule e matrice (matrice nativa) dovrebbe essere facilmente staccabile dalla superficie della piastra e ora dovrebbe galleggiare nel mezzo. Stendere la matrice nativa nel supporto per evitare che si ripieghi su se stessa.
- Lascia fluttuare la matrice nativa e rimodellala per 5 giorni, cambiando i supporti ogni 2-3 giorni. A causa della resistenza alla trazione e del rimodellamento intrinseco all'interno della matrice, la matrice si contrarrà drasticamente e si ridurrà a una matrice nativa più piccola, ma più spessa, pronta per essere utilizzata per il saggio di invasione.
3. Test di invasione con cheratinociti SCC tumorali
- Raccogliere delicatamente la matrice nativa con una pinza smussata e trasferirla su una rete di nylon. Una volta sulla rete di nylon, stendere delicatamente la matrice per distenderla il più piatta possibile utilizzando una punta per micropipetta da 1 ml e una pinza smussata.
- Preparare i cilindri clonali sterili spalmando una piccola quantità di vaselina sterile su un'estremità.
- Posizionare i cilindri clonali sulla matrice nativa, con la vaselina rivolta verso il basso. Questo per garantire una tenuta ermetica tra la matrice nativa e gli anelli clonali.
- Aggiungere cellule cSCC ai cilindri clonali (250.000 cellule in 100 μl di terreno di crescita dei cheratinociti).
- Rimuovere i cilindri clonali dopo 6 ore, quando le cellule cSCC si sono depositate sulla matrice nativa.
- Sollevare la rete di nylon con la matrice nativa e le celle cSCC sull'interfaccia aria-liquido sul supporto in rete metallica piegata in acciaio inossidabile.
- Aggiungere terreni di crescita per cheratinociti integrati con acido ascorbico fino a quando il livello del terreno tocca il fondo della matrice nativa.
- Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni e raccogliere a 7 e 14 giorni, dopo la semina delle cellule cSCC.
