Saggio della dose eritematosa minima: un metodo per misurare la sensibilità ai raggi UV nei modelli murini

Abstract

Fonte: Amaro-Ortiz, A. et al. Induzione farmacologica della melanina epidermica e protezione contro le scottature solari in un modello murino umanizzato. J. Vis. Exp. (2013)

Questo video descrive un metodo per misurare la sensibilità ai raggi UV in un modello murino umanizzato, un modello murino che imita la pelle umana. Determiniamo la dose eritematosa minima (MED) di radiazioni UV che possono causare eritema o edema sulla pelle. Il metodo può aiutare a scoprire l'efficacia dei farmaci utilizzati per ridurre la sensibilità ai raggi UV.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

Determinazione della sensibilità ai raggi UV mediante il calcolo della "Dose Eritematosa Minima" (MED)

1. Utilizzare animali che sono stati pretrattati con veicolo o forskolina. Anestetizzare gli animali con iniezione intraperitoneale di una miscela standard di ketamina e xilazina.
2. Preparare un pezzo di nastro occlusivo UV per il test MED. Per creare fori nel nastro, utilizzare un perforatore per impieghi gravosi con un'apertura circolare di 1 cm² (Figure 1A e B). La presenza di fori di dimensioni definite e la disposizione simmetrica del nastro facilitano il riconoscimento dei cambiamenti della pelle dopo l'irradiazione. Su ogni foro del nastro, applicare un pezzo di nastro piccolo ma facilmente staccabile che può essere rimosso in momenti definiti durante l'esposizione ai raggi UV per consentire la somministrazione di diverse dosi UV.
3. Una volta che gli animali sono adeguatamente sedati, posizionare il nastro sulla superficie dorsale. Il lubrificante per gli occhi deve essere sempre utilizzato in anestesia.
4. Accendi la sorgente UV composta da due lampade Westinghouse F15T8UV-B con un'emissione di picco di 313 nm e un intervallo di 280-370 nm. Lasciare che la lampada si equilibri fino a raggiungere un'emissione UV costante, misurata da un fotometro UV con un sensore UVB (in genere ci vogliono alcuni minuti prima che le lampade si riscaldino).
5. In base alla velocità di trasmissione UV misurata dal fotometro UV, calcolare il tempo di esposizione ai raggi UV per ogni dose desiderata. Ad esempio, l'emissione UVB della nostra lampada misura 2,4 mW/cm². Pertanto, per somministrare 5 kJ/m², la pelle dovrebbe essere esposta a 208 sec (ovvero 3 min e 28 sec) di radiazioni UVB, come calcolato di seguito:
   
6. Posizionare gli animali sedati (ciascuno con nastro occlusivo in posizione) sulla superficie ventrale verso il basso per garantire un'esposizione uniforme ai raggi UV. Per somministrare le dosi scelte di radiazioni UV, rimuovere in sequenza i piccoli nastri occlusivi che coprono i fori per esporre aree di 1 cm² di pelle alle corrette dosi di radiazioni. Pertanto, utilizzando l'esempio precedente, se 40 kJ/m² è la dose più grande nell'esperimento, allora l'animale starebbe sotto la lampada per 27 minuti e 47 secondi in totale e la pelle nella condizione di 40 kJ/m² non avrebbe nastro sovrastante per tutto il tempo. Tuttavia, il nastro sovrastante la condizione di 5 kJ/m² verrebbe rimosso quando rimangono 208 secondi nell'esposizione. I tempi di rimozione del nastro devono essere tali che ogni condizione termini contemporaneamente.
7. Dopo l'esposizione ai raggi UV, staccare con cura il nastro dalla pelle dorsale, facendo attenzione a non strappare la pelle con movimenti improvvisi o eccessivamente energici. Posizionare gli animali in un luogo caldo e tranquillo per consentire il recupero dall'anestesia.
8. Monitorare i topi per 24-48 ore per cercare aree discrete di eritema (arrossamento) o edema (gonfiore) corrispondenti ai siti anatomici esposti alla dose specifica di irradiazione UV. Documenta fotograficamente i risultati della pelle.
9. Il valore MED corrisponde alla dose minima di UV che provoca infiammazione come definita da eritema e/o edema dell'intero cerchio cutaneo esposto. Si noti che la pigmentazione della pelle può sfidare la determinazione della MED, tuttavia, l'eritema e l'edema possono ancora essere generalmente valutati con precisione, grazie in parte alla forma definita delle aperture nel nastro durante l'esposizione ai raggi UV.

Risultati

Figura 1. La melanizzazione indotta da forskolina protegge dall'infiammazione mediata dai raggi UV, come determinato dal test della dose eritematosa minima (MED). (A,B) Posizione del nastro occlusivo UV e delle dosi di UVB di animali trattati due volte al giorno per 5 giorni (A,C) o una volta al giorno per 15 giorni (B,D,E) con veicolo o forskolina. L'ultimo trattame...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Xilazina	Iniezione anasica	LA04612	Shenandoah, Iowa, Stati Uniti
Ketamina HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, Stati Uniti
etanolo	Laboratori Decon.	Codice: 2705
Crema depilatoria, Nair	Chiesa di Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
Lampada Gg germicida UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Fotometro radiometro	Luce internazionale	1LT400A	Peabody, MA, Stati Uniti
Isotesia, isoflurano, USP	Maggiordomo Schein	NCD 11695-6776-1	Dublino, OH, Stati Uniti
Cromatometro	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, Stati Uniti
Processore dati per cromatometro CR-400	Konica Minolta	DR-400	Ramsey, NJ, Stati Uniti