Questo articolo dettaglio il protocollo per la misurazione dell'attività calpaina in cellule fisse e vivere in citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Misurazione dell'attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Calpains sono onnipresenti intracellulari, calcio-sensibili, la cisteina proteasi neutre
Protocollo
Preparare Reagenti
Nota: Tutti i PBS contiene Ca 2 + e Mg 2 +
- Rilevazione dei reagenti
Aggiungi 20μM 7-ammino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina ammide (BOC-LM-CMAC) PBS a temperatura ambiente. Ogni sospensione cellulare richiederà reagente 2 ml di rilevamento. - 1% paraformaldeide (Cellule fisso)
Diluire soluzione al 4% paraformaldeide magazzino a temperatura ambiente PBS. Aliquota paraformaldeide 1 ml 1% a ciascuna provetta FACS. Tre tubi FACS sono necessari per ogni condizione sperimentale (es. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 necessari 9 tubi FACS) - PD1....
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Discussione
L'attività calpaina in cellule 32Dkit fisse e vita è stato determinato in questo protocollo video. Il trattamento della linea cellulare con l'inibitore della calpaina PD150606 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. Inoltre, il trattamento con l'inibitore MEK1 PD98059 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. ERK è un importante attivatore di calpaina-2 3. Questi risultati suggeriscono che l'attività calpaina-2 è predominante nelle .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Supportato da sovvenzioni da parte del Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada e la Fondazione Linfoma del Canada.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldeide | Invitrogen | Sciogliere 4 g di paraformaldeide in 100 mL di PBS. In cappa, riscaldare il campione con agitazione fino a quando diventa limpido. Lasciare raffreddare, quindi conservare a 4°C | |
| PD150606 | Invitrogen | Utilizzare PD150606 ricostituito frescamente per un'inibizione massimale della calpaina. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, AlignFlow più perle fluorescenti, provette FACS | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | Il sopranatante delle cellule WEHI-3 viene utilizzato come fonte di IL-3 in questi esperimenti. Ogni raccolta di sopranatante di WEHI-3 viene titolata per determinare la concentrazione ottimale da utilizzare per la crescita delle cellule 32Dkit. |
Riferimenti
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
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Ristampe e permessi
