Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

Sommario

Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Abstract

Per capire il meccanismo con cui le cellule viventi senso forze meccaniche, e come rispondono e si adattano al loro ambiente, una nuova tecnologia in grado di studiare il comportamento delle cellule a livello sub-cellulare di livello ad alta risoluzione spaziale e temporale è stato sviluppato. Così, un microscopio a forza atomica (AFM) è stato integrato con la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia e in rapida rotazione del disco (FSD) microscopia confocale. Il sistema integrato è ampiamente applicabile per una vasta gamma di studi di dinamica molecolare in alcun cellule aderenti vivere, permettendo diretta imaging ottico delle risposte delle cellule alla stimolazione meccanica in tempo reale. Riorganizzazione significativa dei filamenti di actina e adesioni focali è stato dimostrato a causa di locali stimolazione meccanica sulla superficie cellulare apicale che hanno indotto cambiamenti nella struttura cellulare in tutto il corpo cellulare. Queste tecniche innovative forniranno nuove informazioni per comprendere la ristrutturazione delle cellule vive e dinamiche in risposta alla forza meccanica. Un protocollo dettagliato ed un set di dati rappresentativi che la risposta delle cellule spettacolo dal vivo allo stimolo meccanico sono presentati.

Protocollo

1. Panoramica del sistema integrato di microscopio

Il sistema di microscopio che viene utilizzato per questi studi è stato descritto in dettaglio ^1. In breve, una rovesciata Olympus IX-81 con microscopio TIRF attaccamento (Olympus, Center Valley, PA) è combinata con CSU-22 Yokogawa testa di scansione (Yokogawa Electric Inc, Giappone). Un microscopio SZ Bioscope forza atomica (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) è montato sulla parte superiore del microscopio ottico invertito, e l'intero sistema è collocato su un tavolo grado ricerca ottici (Newport, Irvine, CA).

L'assemblea confocale composto da spinning-disk scanner, esterno ruota portafiltri e la sua macchina fotografica EMCCD (scientifico-Roper fotometrici, Tucson, AZ) sono rigidamente collegati con una piastra base in alluminio posta su un blocco di silicio necessario per lo smorzamento delle vibrazioni. Lo scanner confocale si collega con il microscopio attraverso una flangia con un collare ricostruiti che può essere disaccoppiato dal microscopio AFM durante le misurazioni, in modo che nessuna vibrazione dallo scanner spinning-disk influenzerà le misure AFM. Un Argon-laser Krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) è utilizzato come fonte di eccitazione per entrambi TIRF e modalità di imaging confocale, e possono essere accoppiati in alternativa in due fibre ottiche che offrono il laser per l'attaccamento TIRF o la testa di scansione, rispettivamente . Due computer di controllo del sistema: Slidebook software controlla l'imaging ottico e software Nanoscope controlla l'AFM.

2. Colture Cellulari

Cellule viventi che esprimono GFP costruisce mirati contro specifiche proteine ​​deve essere posto in un piatto di vetro cultura fondo cellulare 24 ore prima l'esperimento stimolazione meccanica. Il giorno dell'esperimento sostituire il terreno di coltura cellulare con rosso fenolo-free medio. Il piatto di coltura cellulare è montato sul palco AFM con un collare magnetico.

3. AFM Suggerimento Preparazione e Microscopio Set-up

La punta AFM personalizzato con un micron 2 biotinilated perle di vetro viene lavato per cinque volte con DPBS e poi incubate 5 min con avidina (1 mg / ml), lavate di nuovo con DPBS cinque volte, e poi incubati 5 minuti con 1 mg / mL biotinilated fibronectina. La punta sarà lavato cinque volte di più alla fine ^2, montata sullo scanner AFM, e poi il facciale in silicone di protezione saranno disposte intorno al titolare. Impostare il microscopio per la visualizzazione di video per allineare la punta AFM al centro del campo visivo. Allineare la leva ottica mettendo il raggio laser alla fine del cantilever, e quindi modificare l'obiettivo di un obiettivo ad alto ingrandimento adeguata per l'imaging di singola cellula. La costante elastica della punta deve essere determinato prima di iniziare l'esperimento. Questo parametro verrà misurato con il metodo termico sintonia disponibili nel software Nanoscope. Passare dalla videocamera a fotocamera EMCCD per consentire l'imaging fioritura. Poi, scegliere una cella e portare la punta AFM in contatto con quella cella specifica. Dopo 20 minuti il ​​tempo di attesa, che è necessario per una forte adesione focale per formare nel punto di AFM di contatto con la superficie cellulare, la procedura di stimolazione meccanica si avvia.

4. La stimolazione meccanica del Live Cell

TIRF ^3-4 di imaging sarà il metodo di scelta per la visualizzazione e la quantificazione adesioni focali, e la filatura del disco di imaging confocale ⁵ sarà utilizzato per la visualizzazione del citoscheletro di actina in tutto il corpo cellulare. L'AFM ⁶ sarà utilizzato nella diagnostica per immagini in modalità di contatto del liquido.

Un'immagine TIRF o confocale della cellula sarà acquisito prima di iniziare la procedura di stimolazione meccanica. La stimolazione meccanica saranno indotti dalla sonda funzionalizzata AFM che verrà spostato verso l'alto in passi discreti ogni 3-5 minuti per un periodo di tempo (1-1.5 ore). La cellula-reattiva risposta sarà registrata in modo continuo nel software Nanoscope come una serie di immagini di altezza, ogni riga dell'immagine che rappresenta una unità di tempo di 1 sec. Durante l'acquisizione dei dati AFM, l'operatore controlla in ogni momento la posizione z della punta AFM per determinare la tempistica adeguata per la spinta successiva.

Dopo ogni stimolazione meccanica è possibile acquisire un'immagine TIRF o confocale della cellula in Slidebook software, mentre continua l'acquisizione di dati AFM. Le immagini ottiche possono essere elaborati off-line per creare filmati che mostrano citoscheletro di actina e focale riorganizzazione aderenze. Inoltre, ogni immagine può essere elaborata quantitativamente per determinare l'area delle cellule, l'area specifica proteina, e analizzare la morfologia generale delle cellule.

Alla fine dell'esperimento viene ritirata la punta AFM dalla cella e la sensibilità punta AFM sarà misurata nel software Nanoscope.

L'esperimento è molto sensibili al rumore! Qualsiasi parlare o microscopio toccando durante la experiment dovrebbe essere evitato. Per ridurre al minimo il rumore nelle misure AFM, la filatura-disk confocale dovrebbe essere disaccoppiato dal microscopio. Il tempo di attesa per formare una forte adesione focale tra la superficie delle cellule e la punta AFM può variare a seconda del tipo di cellule e la matrice rivestito sulla punta.

5. Rappresentante Risultati

Figura 1. Stesso delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) transfettate con l'actina-MRFP e vinculina-GFP è stato ripreso da: (A) AFM sulla superficie cellulare apicale; (B) TIRF sulla superficie delle cellule basali, e (C) spinning-disk microscopia confocale in tutto il corpo cellulare. L'immagine confocale è indicato come proiezione massima di un 3-D stack. Buone le sovrapposizioni tra AFM e TIRF o immagini confocale spinning-disk sono mostrati in (D) e (E), rispettivamente. Dimensione dell'immagine è 64 x 50 micron.

Figura 2. Un VSMC transfettate con l'actina-MRFP era meccanicamente stimolato dal AFM e ripreso da spinning-disk microscopia confocale Le frecce indicano le fibre di actina che:. (A) polimerizzare / addensare, (b) depolymerize / sparire, o (c) Bundle insieme a causa alla ristrutturazione di actina. Linee bianche tratteggiate rappresentano la punta AFM sopra la cella. Dimensione dell'immagine 91 x 91 micron.

Discussione

Aderenze citoscheletro ^7-10 e ^11-16 focali sono strutture dinamiche che assemblano, si disperdono e girare come le cellule migrano o rispondere a forza meccanica ^17. Essi hanno funzioni importanti nella regolazione della crescita cellulare, la sopravvivenza, e l'espressione genica. Conoscendo la loro distribuzione e le dinamiche specifiche fornisce una migliore comprensione di come le cellule comunicano con la matrice e tra loro.

Questo sistema nuovo micr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punta AFM	Novascan Technologies, Inc.		Perlina borosilicata da 2 micron, 0,01 N/m, biotina Superficie
avidina	Sigma-Aldrich	A9275	1 mg/mL in DPBS
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F4759	1 mg/mL
DPBS	Invitrogen	21600-051
Kit di trasfezione Amaxa per cellule muscolari lisce	Lonza Inc.	VPI-1004
Piatti con fondo in vetro Mattek	MatTek Corp.	P60G-1.5-30-F	Piatti Falcon sterili da 60 mm con vetrino coprioggetti con fondo in vetro n. 1.5