RhoC GTPasi attivazione di analisi

Sommario

Questo protocollo utilizza un pull down di analisi per determinare i livelli di attivo GTPasi RhoC all'interno delle cellule.

Abstract

RhoC GTPasi ha il 91% di omologia RhoA GTPasi. A causa della sua diffusione nelle cellule, reagenti e tecniche per molti RhoA GTPasi sono stati sviluppati. Tuttavia, RhoC GTPasi è espressa nelle cellule tumorali metastatiche a livelli relativamente bassi. Quindi, pochi RhoC reagenti specifici sono stati sviluppati. Abbiamo adattato un test per rilevare l'attivazione Rho GTPasi RhoC. Questa tecnica utilizza un GST-Rho legame proteina di fusione del dominio a tirare fuori attivo GTPasi RhoC. Inoltre, siamo in grado di raccogliere proteine ​​totali all'inizio del test per determinare i livelli di totale (GTP e PIL legato) GTPasi RhoC. Questo permette la determinazione di principi attivi rispetto al totale delle GTPasi RhoC nella cella. Diverse versioni commerciali di questa procedura sono stati sviluppati tuttavia, i kit commerciali sono ottimizzati per RhoA GTPasi e di solito non funzionano bene per RhoC GTPasi. Parti del test sono stati modificati, nonché lo sviluppo di una RhoC-anticorpo specifico.

Protocollo

1. Preparare GST-fusione delle proteine

1. Le scorte di glicerolo di batteri competenti JM109 contenenti il ​​primo N-terminale di 90 amminoacidi di Rho rhotekin dominio di legame (RBD) subcloned nel pGEX3x BamH1/EcoR1 vettore sono fatti.
   
   Al fine di garantire alta efficienza Le seguenti operazioni devono essere eseguite per ogni esperimento. Nella nostra esperienza, preparati al momento GST-RBD è la chiave per un test GTPasi robusto e preciso di attivazione.
2. Aggiungere 50 microlitri (approssimativo, senza scongelare) di brodo glicerolo a 50 mL di amplificatore LB e far crescere a 37 ° C durante la notte con agitazione.
3. Diluire 1:10 in 500 ml LB-amp e crescere per 1 h.
4. Indurre GST-produzione di proteine ​​con 0,1 mM IPTG per 2 ore.
5. Distribuire uniformemente in bottiglie da centrifuga e centrifugare, Sorval GSA3 rotore a 5000 giri 4 ° C per 20 min.
6. Risospendere le sfere in bottiglie di centrifuga, 10 ml di tampone di lisi *.
   * Buffer di lisi batterica: 20% di saccarosio, 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na ₂ S ₂ O _5, 2 mM MgCl _{2, 2} mM DTT, Aggiungi fresca PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina.
7. Sonicare 2-3 minuti (dipende dal tipo di ultrasuoni. Usiamo un Fischer di Sonic Dismembranator modello 500 fissato a segno 6, ciclo 50%).
8. Centrifuga, Sorvall SS34, 20 min 10.000 rpm a 4 ° C. A questo punto una piccola aliquota può essere estratto e gestito da SDS-PAGE. Il gel può essere colorato Coomassie e una band dovrebbe essere evidente a 46 kDa.
9. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di 50% di glutatione-Sepharose liquami 4B.
10. Incubare per 30 minuti a 4 ° C con rotazione. Lavare 3 volte con tampone di lisi.
11. Risospendere le sfere GST-RBD/glutatione-Sepharose ad un impasto 50% (circa 1 mL) con GST-pesce tampone **. ** GST-Fish Buffer: 10% glicerolo, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl _2, Aggiungere fresco PMSF, benzamide, aprotinina e leupeptina

2. Fusione GST-pull down assay

1. Usa 5-10 x 10 ⁶ cellule / test
2. Lavare le cellule una volta nel ghiaccio PBS freddo, tenere le piastre in ghiaccio (usiamo un piatto di vetro piano riempito di ghiaccio) e lisare con 0,5 ml di GST-pesce buffer.
3. Incubare 5 minuti in ghiaccio, le cellule raccolta con un poliziotto in gomma o scrapper piatto, trasferimento in microcentrifuga tubo e centrifugare 20.000 rpm 5 minuti a 4 ° C.
4. Trasferire il surnatante in una provetta per microcentrifuga fresca. Prendere 50 microlitri per determinare totale Rho (cioè il PIL + GTP legato).
5. Aggiungere 0,5 ml di perline GST-RBD/glutatione-Sepharose e incubare a 4 ° C, durante la notte con la rotazione.
6. Lavare 6x con GST-pesce buffer.
7. Perline Risospendere in 40 microlitri 2x-Laemelli tampone campione
   A questo punto la concentrazione del totale aliquota proteina Rho preso in 2.4 deve essere determinata e 30 mcg pronto per essere eseguito sul gel con il campione di attivazione corrispondenti.
8. Campioni bollire a 90 ° C per 5 minuti, centrifugare brevemente e prendere surnatante (cioè evitare le perline), caricare ed eseguire su un 12-ben pendenza 4-20% SDS-PAGE gel.
9. Esegui gel senza tensione superiore a 150, il trasferimento alla membrana utilizzando tampone Towbin e costante corrente di 100 W.
10. Blocco della membrana con 5% di latte / TBST soluzione e sonda con RhoC-specfic anticorpi.

3. Rappresentante Risultati

Buoni risultati dovrebbero produrre una singola banda di circa 22 kDa. Cattivi risultati producono bande multiple o fondo elevato. Questo è indicativo di degradazione delle proteine, lavaggio incompleta di campioni o l'utilizzo di vecchi GST-RBD.

Figura 1. Tre linee di cellule distinte che esprimono diversi livelli di RhoC GTPasi sono mostrati per dimostrare bassi livelli di RhoC attivo e totale, alti livelli di RhoC attivo e totale o nessuna RhoC. La macchia è stato poi spogliato e reprobed con un anticorpo alla actina house keeping gene per servire come un controllo di carico per la proteina RhoC totale.

Figura 2. Bande multiple o risultati di elevato background dalla degradazione delle proteine, lavaggio incompleto dei campioni o l'uso di vecchie GST-RBD.

Discussione

La fase più critica della procedura è la generazione di nuove GST-RBD. Il mancato prestare molta attenzione a questo passo è motivo principale per il fallimento. Tutte le fasi, dalla generazione del GST-RBD (1,2) per la notte di incubazione con il lisato cellulare (2,5), dovrebbe essere fatto in un solo giorno. Un altro passo fondamentale è quello di rendere certo che ci sono cellule sufficienti per produrre la lisati cellulari. Questo è di particolare importanza quando si guarda RhoC GTPasi, che tende ad essere present...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perline di glutione-sefarosio 4B	GE Healthcare	17-0756-01
Criterio 4-20% Gel Tris-HCl	Bio-Rad	345-0032