Il organoptypic dell'ippocampo modello cultura fetta è un In vitro utilizzato per esaminare danno neuronale in una varietà di paradigmi. In questo articolo, si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta e quantificare danno neuronale.
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Articolo metodologico
Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l'esame di danno neuronale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Organotipica cultura fetta ippocampo è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale, in cui l'architettura di base e la composizione dell 'ippocampo è relativamente preservata 1. Il sistema di coltura organotipica consente l'esame degli effetti neuronali, astrociti e microglia, ma come preparazione ex vivo, non affronta gli effetti del flusso sanguigno, o reclutamento di cellule infiammatorie periferiche. A tal fine, questo metodo cultura viene spesso utilizzato per esaminare lesioni eccitotossico e ipossia ai neuroni piramidali dell'ippocampo, ma è stato utilizzato anche per esaminare la risposta infiammatoria. Qui si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta dell'ippocampo dal cervello di roditori dopo la nascita, l'amministrazione stimoli tossici per indurre danno neuronale, e il saggio e la morte dei neuroni dell'ippocampo quantificare.
Protocollo
1. Preparazione
Prima di iniziare, montare gli strumenti chirurgici necessari, dissezione e terreni di coltura, e 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo. Il protocollo è lo stesso per il mouse e preparati ratto.
(I) Materiali e attrezzature
- Forbici operativo (dritto lunghezza 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Micro dissezione forbici, (lunghezza 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
- Acciaio al carbonio Dumont Pinzetta (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
- Modificato vetro "trasferimento" pipette (in fondo alla pipetta Pasteur rimosso e levigato bordo)
- Aclar pellicola di plastica tagliata a 2 "in x 2" nelle piazze (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
- Copertura spugne 4 in da 3 a (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
- 30 millimetri inserti membrana Millicell (0,4 micron; Millipore, Bedford, MA)
- Mcllwain chopper tessuto a doppio taglio con lama di rasoio (chopper tessuto McIlwain, Società Vibratome, St. Louis, MO)
- Microscopio invertito con telecamera CCD e software di analisi dell'immagine
(Ii) Medio Dissection (DM; 1 litro a pH 7,3)
| Sale bilanciata di Hank | 1 flacone (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) |
| NHCO 3 (4,2 mm) | 350 mg |
| HEPES (10 mM) | 2,83 g |
| Glucosio (33,3 mM) | 6,0 g |
| Penicillina / streptomicina (100x) | 10 mL |
| BSA (0,3%) | 300 mg |
| MgSO 4-7H 2 O | 1,44 g |
(Iii) di media cultura (400 ml)
| MEM (Invitrogen 11575-032) | 200 mL |
| *** Hank Salt Balance (Invitrogen 24020-117) | 100 ml |
| Siero di cavallo (Invitrogen 26050-070) | 100 ml |
| HEPES tampone (1 M; Invitrogen 15630-080) | 5 ml |
| Penicillina / streptomicina (100x) | 4 mL |
| *** Aggiungere 12,8 g di glucosio a Salt Balance 500 ml di Hank prima di fare un terreno di coltura | |
(Iv) gli animali
7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo postnatale, in genere una cucciolata per esperimento.
2. In occasione della Giornata della Cultura
- Tutti gli strumenti di dissezione e film Aclar devono essere immersi nel 70% ETOH per 30 minuti prima dell'inizio. La superficie del cofano dissezione, lama, e chopper di tessuto devono essere disinfettate con etanolo.
- Preparare diversi (3-4) 6 pozzetti coltura tissutale; aggiungere 1 ml terreno di coltura per bene, e inserire una membrana permeabile Millipore in ciascun pozzetto. Posto a 6 pozzetti nel 37 ° incubatore fino al momento di trasferire fette.
- Preparare diversi (4-6) 60 mm con piastre di DM e posto sul ghiaccio.
- Rapidamente decapitare con le forbici e tuffo nel 70% ETOH, e rapidamente esporre il cervello con un incisione sagittale del cranio. Rimuovere con cura il cervello e il posto immediatamente a freddo DM. Separato in due emisferi e porre ogni lato mediale emisfero in giù su una spugna copertina per 2-3 secondi.
- Sollevare delicatamente e luogo nell'emisfero sulla piazza pellicola Aclar e luogo l'elicottero del tessuto; tagliare il cervello coronale in 350 sezioni micron. Al termine, dolcemente prendere la piazza Alcar con l'emisfero sezionato e immergere in acqua fredda DM.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, separare le sezioni dell'ippocampo. Per ratto, ci dovrebbe essere 5 sezioni di ippocampo spanning rostrale caudale, e per il mouse ci dovrebbe essere sezioni 3-4.
- Estrarre il 6-pozzetti con inserti membrana dal 37 ° tessuto cultura incubatore. Trasferimento fettine di ippocampo individualmente sulle membrane permeabili con la pipetta di trasferimento di vetro. Se troppo DM viene rilasciato sulla membrana, DM rimuovere l'eccesso con una pipetta Pasteur. Luogo cinque fettine di ippocampo su ogni membrana. Lasciare almeno 3 pozzi per condizione o 15 fette.
- Incubare le piastre di coltura a 37 ° in un incubatore CO 5% umidificata per 12-14 giorni prima di iniziare l'esperimento tossicità. Il terreno di coltura può essere cambiato due volte la settimana.
3. Indurre e Quantificare ippocampale danno neuronale nella cultura Slice
- Dopo 12-14 giorni di cultura, aggiungere 5 mg / ml di ioduro di propidio (PI) per terreni di coltura. Questo passo permetterà la visualizzazione e la quantificazione della morte delle cellule basali.
- Il giorno seguente, quantificare PIfluorescenza nella subregione CA1 (e / o CA3 dentato o se lo si desidera) di ogni fetta e dell'ippocampo significa ottenere le misure PI fluorescenza rappresenta la morte delle cellule basali (indicato come tempo = 0 ore, o T 0). Per l'acquisizione delle immagini e quantificazione, si usa il software OpenLab (improvvisazione, Regno Unito), ma l'acquisizione di immagini e altri software di analisi può essere utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza.
- Immediatamente dopo l'acquisizione di immagini del T 0 PI fluorescenza, indurre danno neuronale dal metodo di scelta (abbiamo utilizzato 10 micron NMDA, deprivazione di ossigeno e glucosio, o LPS per un'ora per indurre tossicità neuronale 2,5). Dopo lo stimolo tossico, sostituire media con terreno fresco contenente 5 mg / ml PI e mantenere fette di notte.
- Il giorno 3, significa quantificare PI fluorescenza della condizione sperimentale in 24 ore, o T 24.
- Dopo questa acquisizione delle immagini, cambiare immediatamente medio e aggiungete 10 micron NMDA e 5 mg / ml PI e fette incubare una notte per raggiungere la massima morte neuronale.
- Il giorno 4, significa quantificare fluorescenza PI massima di morte neuronale, definita come T max. Calcolare la morte delle cellule per cento come segue: (T 24 - T 0) / (T max T-0).
4. Rappresentante Risultati
Figura 1. (A) Linea Tempo per la generazione di dell'ippocampo e successive lesioni sperimentali e di acquisizione delle immagini. (B) immagini Rappresentante di fettine di ippocampo basale (T 0), 24 ore dopo una esposizione 1 ora per mM NMDA 10 (T 24), e dopo ulteriori 24 ore o 10 mM NMDA di ottenere la massima lesione neuronale (T max).
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Discussione
Ci sono due punti importanti da seguire per garantire risultati riproducibili e coerenti quando si replica esperimenti. In primo luogo, è importante lasciare che l'età dell'ippocampo fette per 12-14 giorni prima della sperimentazione. Con isolamento fetta, vi è una significativa risposta della microglia, e microglia rimangono attivi per un certo tempo, con un ritorno ad uno stato di riposo ramificata che si verificano di giorno 10 in vitro 3,6. In secondo luogo, intensità media PI fluorescenz...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Finanziato dal NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes
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Riferimenti
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
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Ristampe e permessi
