Un modello ortotopico di carcinoma ovarico sieroso in topi immunocompetenti per In vivo Tumore Imaging e monitoraggio del tumore Risposte immunitarie

Sommario

Per studiare In vivo La crescita tumorale e microambiente tumorale, abbiamo utilizzato un modello murino singenici e ortotopico di carcinoma ovarico negli animali immunocompetenti. Noi trasdotte un tumore linea di topi cellule (MOV1) con una proteina fluorescente Katushka (MOV1 ^KAT) E qui vi mostriamo il suo impianto ortotopico in ovaio e In vivo Immagini.

Abstract

Background: Il cancro ovarico è generalmente diagnosticato in fase avanzata in cui il caso / rapporto di mortalità è alta e rimane quindi il più letale di tutte le neoplasie ginecologiche tra Stati Uniti le donne ^1,2,3. Tumori sierosi sono le forme più diffuse di cancro ovarico e ^4,5 il Tg-MISIIR-Tag transgenici rappresenta l'unico modello del mouse che si sviluppa spontaneamente questo tipo di tumori. Tg-MISIIR-Tag topi esprimere SV40 regione trasformando sotto il controllo del Mulleriani inibitori della sostanza di tipo II Receptor (MISIIR) del gene promotore ^6. Ulteriori linee transgeniche sono state identificate che esprimono il transgene TAG SV40, ma non sviluppano tumori ovarici. Topi inclini non tumorali mostrano tipica vita per C57BL / 6 topi e sono fertili. Questi topi possono essere utilizzate come riceventi trapianto allogenico di singenici per le cellule tumorali isolate dai Tg-MISIIR-Tag-DR26 topi.

Obiettivo: Sebbene l'imaging del tumore è possibile ^7, la diagnosi precoce dei tumori in profondità è una sfida in animali che vivono di piccole dimensioni. Per abilitare studi preclinici in un modello animale immunologicamente intatta per il cancro ovarico sieroso, si descrive un modello di topo singenici per questo tipo di tumore ovarico che permette di imaging in vivo, gli studi del microambiente tumorale e tumore risposte immunitarie.

Metodi: Per prima cosa deriva a + TAG cancro linea di topi cellule (MOV1) da un tumore ovarico spontanee raccolte in un 26 settimane di età DR26-Tg MISIIR-Tag femminile. Poi, abbiamo MOV1 cellule trasdotte stabilmente con TurboFP635 vettore Lentivirus mammiferi che codifica Katushka, un far-rosso mutante della proteina fluorescente rossa dal mare anemone Entacmaea quadricolor con eccitazione / emissione di massimi a 588/635 nm ^8,9,10. Noi ortotopicamente impiantato MOV1 ^Kat nell'ovaio ^11,12,13,14 della non-tumorale inclini Tg-MISIIR-Tag topi femmina. Progressione del tumore è stata seguita da in vivo imaging ottico e microambiente tumorale è stata analizzata mediante immunoistochimica.

Risultati: ortotopicamente MOV1 impiantato cellule ^Kat sviluppato tumori ovarici sierosi. MOV1 ^Kat tumori possono essere visualizzate da imaging in vivo fino a tre settimane dopo l'impianto (fig. 1) e sono stati infiltrati con leucociti, come osservato nei tumori ovarici umani ¹⁵ (fig. 2).

Conclusioni: descrivere un modello ortotopico di carcinoma ovarico adatto per imaging in vivo di tumori presto a causa della elevata pH stabilità e fotostabilità di Katushka nei tessuti profondi. Proponiamo l'utilizzo di questo modello romanzo singenici del carcinoma ovarico sieroso per gli studi di imaging in vivo e il monitoraggio dei tumori risposte immunitarie e le immunoterapie.

Protocollo

1. Colture Cellulari

1. Prima dell'iniezione ortotopico, cultura MOV1 cellule ^Kat, derivate da tumori DR26, in un pallone T175 fino a quando non sono al 90% confluenti. Prevede di utilizzare 1-5.000.000 cellule per iniezione, che richiede 1 o 2 T175 fiaschi.
2. Il giorno della iniezione, raccogliere le cellule e determinare il numero delle cellule utilizzando un emocitometro.
3. Una volta che la concentrazione cellulare è stata determinata, agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 minuti a 300 g X a temperatura ambiente.
4. Dopo la rotazione, risospendere le cellule di avere 1 milione in 10 microlitri di PBS sterile con EDTA 0,002 M

2. Pre-Surgery

1. Prima dell'intervento, riempire una siringa da insulina 3/10cc con 1 milione di ^MOV1-Kat cellule in 10 microlitri di PBS EDTA.
2. Trasferimento di un mouse isofluorane anestetizzati per una piastra elettrica. Aggiungi unguento oculare per prevenire la disidratazione dell'occhio. Poi, subito inserire la testa dell'animale in un sistema di cono collegato ad un vaporizzatore isoflurano per fornire anestesia durante l'intervento chirurgico.
3. Dopo la disinfezione del sito di iniezione con tamponi imbevuti di alcool, iniettare per via sottocutanea 5 mg / kg di ketoprofene, un pre-chirurgica analgesico, con una siringa da insulina 3/10cc.
4. Utilizzando Clippers, radersi la porzione caudale sinistra del dorso dalla giunzione toraco-lombare alla base della coda dell'animale. Applicare la crema di rimozione dei capelli per rimuovere completamente i capelli. Quindi, rimuovere l'eccesso con un tovagliolo di carta bagnato.
5. Una volta che il pelo è stato rimosso, sterilizzare l'area rasata con povidone-iodio e tamponi imbevuti di alcool. Poi, posto un drappo chirurgico intorno alla zona di incisione.

3. Chirurgia

1. Poco prima dell'intervento, regolare i livelli vaporizzatore isoflurano al 1,5%.
2. Verificare che l'animale è completamente anestetizzato pizzicando la zampe.
3. Quindi, individuare la milza sotto la pelle. Quindi, utilizzando forbici chirurgiche, fare una incisione dorsolaterale 1-2 cm di lunghezza in alto a destra della milza.
4. Sezionare il retroperitoneo. Il cuscinetto che circonda l'ovaio del mouse verrà osservato. Utilizzare pinze curve di cogliere e di esporre il cuscinetto adiposo che circonda l'ovaio mouse.
5. Idratare l'organo con qualche goccia di PBS sterile.
6. Utilizzare pinze curve di cogliere, ritrattare ... posizione ... e poi sicuro l'ovaio per l'iniezione
7. Ferma cogliere il ovario con le pinze, iniettare 10 microlitri di MOV1 cellule tumorali ^Kat in dell'ovaio. Una solida conoscenza impedisce il rigurgito dei fluidi o perdite.
8. Subito dopo l'iniezione, allentare la tensione esercitata dal forcipe. La perforazione nell'ovaio dovrebbe spontaneamente ritrattare e chiudere.
9. Utilizzando una sutura assorbibile acido poliglicolico attaccato ad un ago, chiudere il retro-peritoneo ferita.
10. Rilasciare l'animale dal cono naso.
11. Tendere la pelle e sigillare i lembi della ferita dorsolaterale con qualche goccia di adesivo tissutale.
12. Infine, somministrare per via orale 100 microlitri di antibiotici per l'animale. Poi metterlo di nuovo nella sua gabbia e monitor per il recupero. Tenere l'animale sotto antibiotici nell'acqua da bere per una settimana.

4. Imaging in vivo

1. Una settimana dopo l'iniezione ortotopico di MOV1 cellule tumorali ^Kat, eseguire imaging in vivo. Iniziare con il trasferimento di un mouse isofluorane anestetizzato alla camera di imaging.
2. Girare il livello isoflurano vaporizzatore fino al 2%.
3. Eseguire imaging in vivo secondo le istruzioni del produttore del sistema di imaging è. In questo video, il sistema Lumina verrà utilizzato.
4. Per l'immagine, clicca l'immagine vivente icona del software desktop. Poi, sul pannello di controllo acquisizione IVIS, selezionare "Initialize". Le impostazioni dello strumento sono analoghi ad una le impostazioni della fotocamera
5. Sul pannello di controllo acquisizione impostare i parametri di acquisizione dello strumento. Per fluorescenza, selezionare "fluorescente". Fare clic sulla casella Fotografia di acquisire una fotografia con ogni immagine.
6. Successivamente, impostare il tempo di esposizione come Auto. In "pixel binning o CCD risoluzione", selezionare "Medio". Poi sotto F / stop o diaframma, controllare il valore di 2. Avanti, selezionare il filtro di eccitazione 535 e il filtro per le emissioni DsRed.
7. In campo di vista, fare clic su View B per l'immagine di un mouse.
8. Quindi, fare clic su acquisire per iniziare l'acquisizione di immagini.
9. Una volta che l'acquisizione delle immagini è completa, utilizzare la regione di interesse, o ROI, strumento per la misura del segnale. Fare clic sull'icona di misura per liberare i valori del segnale e la zona.
10. Infine, fare clic su "salva" per salvare l'immagine nella cartella utente
11. Dopo le immagini sono state salvate, interrompere la somministrazione di isoflurano e restituire il mouse per la sua gabbia. Il mouse deve svegliarsi immediatamente.

5. Rappresentante Risultati

-Usando questo protocollo, La crescita in vivo di un cancro ovarico ortotopico possono essere monitorati per almeno 3 settimane su una procedura non invasiva.

Figura 1. MOV1 cellule ^Kat, o PBS come controllo negativo, sono stati iniettati nel ortotopicamente ovaie di topi soggetti non tumorali (animali e animali a destra e sinistra, rispettivamente). Imaging in vivo è stato effettuato 2 settimane più tardi. L'emissione di fluorescenza generata da MOV1 ^Kat cellule trapiantate nelle ovaie è stata misurata e confrontata con quella di topo di controllo negativo.

Figura 2. Sezioni congelate di MOV1 tumori ovarici ^Kat sono state colorate con biotinilato anti-CD4 mAb seguito da substrato DAB (marrone scuro) per rilevare tumore dei linfociti infiltranti (freccia nera). Le cellule sono state di contrasto con metil-verde per visualizzare nuclei cellulari (blu). Cellule tumorali (frecce rosse) sono stati morfologicamente distinte dalle cellule T. La diapositiva appare ingrandita 40x.

Discussione

Chirurgia e iniezioni ortotopico

Iniezione ortotopico in borsa ovarica esigenze di formazione e di precisione. Così

1. In caso di scarsa esperienza chirurgica, la pratica di cadaveri per primo.
2. Usare preferibilmente donne multipare (uno o due cucciolate), come si sviluppano più grandi ovaie nel tempo che facilita l'iniezione e la sopravvivenza aumentano confrontare con le femmine nullipare.
3. A causa delle piccole dimensioni della borsa ovarica del mouse, l'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM-GLUTAMAX	Invitrogen	10564-011
PBS	GIBCO, by Life Technologies	14040
Versene	Lonza Inc.	17-711E
Piastra riscaldante	Deltaphase	39 DP
Dischetti di povidone	Dynarex	1108
Dischetti alcolici	Fisher Scientific	06-669-62
Unguento artificiale per lacrime	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	17845-153
Chetoprofene	Fort Dodge Animal Health
Siringa da 3 cc/insulina	BD Biosciences	309301
Sutura/ago in poliglicolato (3/8 19 mm)	Syneture	9612-31
Adesivo tissutale	Vetbond	3M
Vet Bactrim/sospensione orale	Hi-tech Pharmacal	840823
IVIS-Lumina	Caliper Life Sciences
Isofluorano	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	J108013
Siero fetale bovino, qualificato	Invitrogen	10437036
Penicillina/streptomicina	GIBCO, by Life Technologies	15140
Vettore mammifero TurboFP635	Evrogen	FP721
Flaconi T175	cellstar	660-190