In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo termine Ex-ovo Cultura embrione aviaria. Questa tecnica è ideale per la sperimentazione longitudinale che richiedono una completa accessibilità ottici e / o il trasporto sterile negli embrioni aviaria.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere le relazioni tra fattori genetici e microambientali che guidano normali e malformate sviluppo embrionale è fondamentale per scoprire nuove strategie terapeutiche. I progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso indagine quantitativa dell'organizzazione e della maturazione del piano di corpo, ma una fase successiva morfogenesi embrionale è meno chiara. Embrioni di pollo sono un interessante modello animale vertebrato sistema per questa applicazione a causa della sua facilità di cultura e di manipolazione chirurgica. Embrioni precoci possono essere coltivate per un breve periodo su anelli carta da filtro, che permette l'accesso completo ottici per patterning cellulare e il destino 1,2 studi. Lo studio dei processi avanzati dello sviluppo come morfogenesi cardiaca sono tradizionalmente svolte attraverso una finestra del guscio 3-5, ma questa tecnica limita l'accesso ottico a causa delle dimensioni della finestra. Abbiamo già messo a punto un metodo semplice per la cultura embrioni interi franco-ovo su esagonale pesare imbarcazioni fino a 10 giorni, che ha permesso di imaging ad alta risoluzione tramite ecografia 6,7. Queste culture sono state difficili da trasportare, limitando i tipi di strumenti di imaging disponibili per esperimenti dal vivo. Noi qui presenti una migliore senza guscio sistema di coltura con un costo-efficace, camera portatile ambientale. Uova erano incrinate su un amaca creato da una membrana poliuretanica (pellicola trasparente) apposto la circonferenza un bicchiere di plastica parzialmente piena d'acqua sterile. Le dimensioni della circonferenza e la profondità della amaca erano entrambi critici per mantenere la tensione superficiale, mentre la meccanica del amaca e acqua sotto aiutato smorzare le vibrazioni indotte dal trasporto. Un piccolo ingombro circolante bagno d'acqua è stato anche sviluppato per consentire un controllo continuo della temperatura durante la sperimentazione. Dimostriamo la capacità di embrioni cultura in questo modo per almeno 14 giorni senza difetto morfogenici o ritardi ed impiegare questo sistema in microchirurgia diversi e applicazioni di imaging.
Protocollo
1. Ex-ovo Cultura protocollo:
- Incubare uova di gallina fecondate
- Uova di gallina fecondate possono essere conservati a 13 ° C fino a 5 giorni prima di incubazione senza avviare lo sviluppo. Un raffreddamento di vino rosso in grado di mantenere questa temperatura.
- Incubare le uova lato smussato in un incubatore di umidità del 60% costante con dondolo continuo a 37,5 ° C per 72 ore.
- Preparare amache (Figura 1a)
- Riempire ¾ di 9 bicchieri di plastica oz con acqua calda sterile. Un regolare 9 oz tazza ha un diametro superiore di 8 cm. Abbiamo scoperto che queste dimensioni er....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Accesso ottico e sperimentazione negli embrioni aviaria è una sfida a causa dei vincoli del guscio d'uovo. Windowing limita in modo significativo il numero di accesso per gli approcci di iniezione e microchirurgia 8 microvasi. Di conseguenza solo gli embrioni precoci possono essere manipolati e costante osservazione non è possibile. Primi ex-ovo culture utilizzando piastre di Petri erano di uso limitato a causa di un inadeguato controllo della tensione superficiale sull'embrione impedito a lu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Uova di gallina Leghorn bianca feconde | |||
| Modello GB1, forni di incubazione Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Elastici | |||
| Acqua sterile calda | |||
| Bicchiere di plastica da 9 oz | |||
| Piatto di Petri da 100 mm di diametro | |||
| Aria termica 1602N | GQF Manufacturing | ||
| Destrano coniugato con fluoresceina (2 MDa, 1% p/v in soluzione salina fosfato tampone) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforno | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Capillari di vetro (0,75 mm di diametro interno) | |||
| Micromanipolatore | World Precision Instruments, Inc. | Modello M3301L | |
| Microscopia a fluorescenza | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Pinzette fini da 55 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Chirurgico in nylon 10-0 | Ethicon Inc. | ||
| Tubulazione | VWR international | 1 mm di diametro esterno | |
| Siringa da 3 mL | BD Biosciences | ||
| Pipetta da 200 μL e punte per pipetta | VWR international |
Riferimenti
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
