Forniamo un metodo per isolare e popolazioni coltura pura di cellule endoteliali valvola cardiaca (VEC). VEC può essere isolato da entrambi i lati della cuspide o depliant e subito dopo, alla base di cellule interstiziali (VIC) isolamento è semplice.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule endoteliali valvolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Valvole cardiache è l'unico responsabile per il mantenimento del flusso unidirezionale del sangue attraverso il sistema cardiovascolare. Queste sottili, tessuti fibrosi sono sottoposti a notevoli sollecitazioni meccaniche come aprire e chiudere diversi miliardi di volte in un ciclo di vita. L'incredibile resistenza di questi tessuti è dovuta alla valvolare residente endoteliale (VEC) e le cellule interstiziali (VIC) che costantemente la riparazione e rimodellare in risposta a segnali meccanici locali e biologici. Solo di recente abbiamo cominciato a capire i comportamenti unica di queste cellule, per il quale nella sperimentazione in vitro ha svolto un ruolo chiave. Particolarmente impegnativo è l'isolamento e la coltura di VEC. Particolare cura deve essere utilizzato dal momento in cui il tessuto viene rimosso dal host tramite placcatura finale. Qui vi presentiamo i protocolli per l'isolamento diretto, isolamento laterale specifico, la cultura, e la verifica delle popolazioni pura VEC. Noi usiamo digestione enzimatica seguita da una tecnica delicata raschiatura tampone per staccare le cellule di superficie. Queste cellule vengono poi raccolti in un tubo e centrifugati in un pellet. Il pellet viene quindi risospeso e placcato in fiasche cultura pre-rivestito con collagene I matrice. Fenotipo VEC è confermata dal contatto inibito la crescita e l'espressione di marcatori endoteliali specifici come PECAM1 (CD31), fattore di von Willebrand (vWF), e l'espressione negativa di alfa-actina del muscolo liscio (α-SMA). Le caratteristiche funzionali di VEC sono associati con alti livelli di LDL acetilato. A differenza di cellule endoteliali vascolari, VEC hanno la capacità unica di trasformare in mesenchima, che normalmente si verifica durante la formazione embrionale valvola 1. Questo può verificarsi anche durante confluenti in modo significativo dopo prolungata coltura in vitro, per cui la cura dovrebbe essere fatto per il passaggio o in prossimità confluenza. Dopo l'isolamento VEC, popolazioni pure di VIC può quindi essere facilmente acquisita.
Protocollo
1. Preparazione
- Autoclave in uno strumento vassoio coperto i seguenti elementi:
- Forcipe del tessuto seghettato - Per la gestione del tessuto volantino
- Forbici dei tessuti (8 cm) - Per tagliare i tessuti depliant e cuspidi
- Tamponi di cotone - per isolare lo strato endoteliale dal volantino o cuspide
- Fai la soluzione sterile collagenasi
- Aggiungere 4,0 grammi di polvere DMEM a 250 ml di 18 MΩ acqua.
- Aggiungere 1,11 grammi di bicarbonato di sodio.
- Aggiungi (600 U / mL) 180.000 unità di collagenasi.
- Aggiungere 1% (3 ml) Penicillina / Streptomicina.
- Regolare il pH d....
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Discussione
La comprensione della biologia valvolare è stata compromessa da difficoltà tecniche di isolamento e la coltura popolazioni di puro valvolare cellule endoteliali. Tecniche di isolamento tipico coinvolgere digestione enzimatica della matrice sottostante basale o chimica di dissociazione dei legami adesivi endoteliale 2,3. Isolamento esperimenti preliminari sono stati valutati qualitativamente variando agenti dissociazione e periodi di incubazione. I risultati di questi esperimenti hanno dimostrato che l'EDT.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questa ricerca è sostenuta dal riconoscimento alla CARRIERA NSF, la Fondazione Hartwell, e l'American Heart Association (# 0830384N).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo di coltura di Eagle modificato di Dulbecco’s | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Serum bovino fetale | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillina-Streptomicina | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Tripsina-EDTA 0,25% | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Sale sodico di eparina | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenasi di tipo 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Congiuntivo di coda di ratto | BD Biosciences | 354236 | |
| Tamponi critici | VWR international | 89031-270 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| Flaconi T25 | BD Biosciences | 353018 | |
| Flaconi T75 | BD Biosciences | 353136 | |
| Piastra a 24 pozzetti | Falcon BD | 353047 | |
| Piastre da 60x15 mm | VWR international | 25384-092 | |
| Piastre di vetro da 60x15 mm | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffina per inclusione | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Aghi Precision Glide | BD Biosciences | 305165 | |
| Filtri Nalgene da 500 mL | VWR international | 73520-985 | |
| Filtri Nalgene da 1 L | VWR international | 73520-986 | |
| Pinze per tessuti | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| Pinzette FSC n. 5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
Riferimenti
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N.
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Ristampe e permessi
