Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Summary

L'identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l'uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Abstract

Immunità adattiva è una componente importante della clearance dei patogeni intracellulari. La capacità di rilevare e quantificare queste risposte negli esseri umani è un importante strumento diagnostico. L'analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT) sta guadagnando popolarità per la sua capacità di identificare le risposte immunitarie cellulari contro gli antigeni microbici, comprese le popolazioni immunodepressi, come quelli con infezione da HIV, trapianto e uso di steroidi. Questo test ha la capacità di quantificare le risposte immunitarie contro specifici antigeni microbici, così come distinguere se queste risposte sono Th1 e Th2 nel carattere. ELISPOT non si limita al sito di infiammazione. E 'versatile nella sua capacità di valutare per le risposte immunitarie all'interno del sangue periferico, così come i luoghi di coinvolgimento attivo, come lavaggio broncoalveolare, liquido cerebro-spinale, e ascite. Rilevazione delle risposte immunitarie contro una antigeni singoli o multipli è possibile, così come epitopi specifici all'interno di proteine ​​microbiche. Questo saggio facilita la rilevazione di risposte immunitarie nel corso del tempo, così come distinzioni antigeni riconosciuti dalle cellule T ospite. Doppio ELISPOT colori sono disponibili per il rilevamento di espressione simultanea di due citochine. Recenti applicazioni di questa tecnica sono la diagnosi di tubercolosi extrapolmonare, nonché la ricerca del contributo di antigeni infettive alle malattie autoimmuni.

Protocol

Per il seguente protocollo, usiamo le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come le cellule di interesse. Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule. Eseguire il test in una cappa coltura di tessuti con tecnica sterile.

Giorno 1: Preparazione della piastra e celle

1. Estrarre una piastra ELISPOT e aprirlo nel cappuccio.
2. Lavare la piastra 3 volte con 150 ml di PBS 1X utilizzando una pipetta multicanale, se disponibile, altrimenti solo pipettaggio bene è accettabile.
3. Prendete un pacchetto di serbatoi e aprirlo nel cofano.
4. Aggiungere 2 mg / mL di anticorpo di cattura, anti-umano interferone-γ, a 11 ml di PBS 1X. Vortex bene. Trasferimento mix di anticorpi ad un serbatoio.
5. Mettere 100 microlitri della soluzione del rivestimento in ciascun pozzetto utilizzando il multicanale.
6. Avvolgere la piastra in parafilm.
7. Porre la piastra in frigorifero per una notte. Le piastre sono buone per settimane. La regola generale è che se c'è ancora lasciato liquido nei pozzi, la lastra può essere utilizzato.

Preparazione delle cellule

Se i PBMC sono freschi poi contare le cellule e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO _2. Per PBMC conservati in azoto liquido, scongelamento delle cellule è necessaria. Il protocollo è il seguente:

1. Scongelare la provetta Microbank ™ di cellule in bagno d'acqua a 37 ° C fino quasi completamente scongelati.
2. Immediatamente risospendere in 5 ml di R10 media.
3. Spin per 5 minuti a 225 x g.
4. Risospendere nuovamente in 5 ml di R10 media e contare le cellule vitali con trypan blu.
5. Portare la concentrazione di 2 x 10 ⁶ cellule / ml in R10 media.
6. Riposo durante la notte a 37 ° C con 5% di CO _2.

Giorno 2: Configurare la piastra

1. Etichetta coperchio piatto con il numero del campione di identificazione, le condizioni bene, e la data.
2. Lavare la piastra 6 volte con 150 ml di PBS sterile 1x con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. Questo potrebbe causare la pozzetti della piastra a diventare viola.
3. Aggiungere 100 ml di R20 in ciascun pozzetto.
4. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora.
5. Mentre la piastra è in incubazione, contare le cellule che sono state riposato durante la notte.
6. Gira la sospensione cellulare a 1500 rpm per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in modo da avere una concentrazione finale di 1x10 ⁶ cellule per 1 ml a R10 media.
7. Dopo l'incubazione 1 ora, togliere la R20 con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping.
8. Aggiungere 100 ml di soluzione delle cellule (10 ⁵ cellule) in ogni pozzetto. Aggiungi peptidi appropriati e / o antigeni nei pozzetti corrispondenti in duplice copia. Usare un puntale nuovo ogni volta che vai nella soluzione di peptide di lavoro. Concentrazione di peptide normale è 10-40 mg / ml. Dal peptidi variano, ogni investigatore dovrebbe titolare peptidi per ottenere risultati ottimali.
9. Nei pozzetti di controllo negativo, solo aggiungere le celle (non peptidi)
10. Nei pozzetti di controllo positivo, aggiungere fitoemoagglutinina (PHA, 10 mg / ml; Sigma).
11. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO ₂ (~ 18 ore).

Giorno 3: Sviluppare la piastra

1. Lavare la piastra 6 volte con 150 microlitri 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia.
2. Aggiungere 100 l di PBS in ciascun pozzetto della piastra utilizzando il pipettatore multicanale.
3. Mettete la placca in frigorifero per 15 minuti.
4. Prendete il piatto dal frigorifero e posizionarlo nel cappuccio coltura di tessuti.
5. Preparare la soluzione di anticorpi biotina
   • Aggiungere 0,5 mg / mL di anticorpi biotina (mAb 7-B6-1) a 11ml di PBS.
   • Vortex la soluzione a mescolare bene.
   • Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio.
6. Eliminare il PBS da sfogliando in cestino. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping.
7. Mettere 100 microlitri della soluzione in ogni pozzetto.
8. Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per un'ora.
9. Lavare piastra 6 volte con 150μL 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 ^°, lasciare la PBS nel piatto prima di aver preparato l'anticorpo Streptavidina.
10. Preparare l'anticorpo Streptavidina.
    • Aggiungere 5,5 μ l Streptavidina anticorpi (streptavidina-ALP) a 11ml di PBS (diluizione 1:2000).
    • Vortex la soluzione a mescolare bene.
    • Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio.
11. Gettare la PBS rimanenti nei pozzetti e asciugare la piastra.
12. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di streptavidina in ciascun pozzetto.
13. Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per 1 ora.
14. Lavare le piastre 6 volte con PBS usando la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 ^°, lasciare la PBS sul piatto fino a quando non hanno fatto la soluzione del colore.
15. Lavorare al buio. Preparare la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina substrato Kit IV BCIP / NBT):
    • Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 1-11 ml Tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato da 2 a tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 3 a tampone Tris, vortice bene.
16. Eliminare le rimanenti PBS e asciugare la piastra.
17. Aggiungere 100 microlitri della soluzione del colore a ciascun pozzetto della piastra con il multicanale.
18. Accendere la luce, dopo 5 a 10 minuti di colore via di sviluppo.
19. Lasciare i reagenti colore di rimanere sul piatto fino a quando i punti cominciano a diventare viola e sono abbastanza scure. Questo dovrebbe richiedere da 5 a 20 minuti. Fare attenzione a non lasciare la soluzione substrato troppo a lungo, perché ciò potrebbe causare fondo elevato.
20. Lavare la piastra ELISPOT 3 volte con l'acqua del rubinetto.
21. Lasciare asciugare per circa un'ora o durante la notte.
22. Leggere la piastra manualmente o con lettore di piastre ELISPOT.
23. Conservare la piastra in una scatola lontano da esposizione alla luce.

Rappresentante dei risultati:

ELISPOT è stato progettato per quantificare la risposta immunitaria contro gli antigeni microbici. Ogni spot indica una singola cellula di risposta, che esprime la citochina di interesse. Gli spot possono essere contati manualmente o tramite un lettore di piastre ELISPOT.

Valutazione che il ELISPOT è stato eseguito correttamente dovrebbe iniziare con un'indagine del controllo negativo per la produzione sfondo della citochina di interesse. Nei pozzetti di controllo negativo ci si aspetterebbe di vedere nessuna macchia, anche se un po 'di storia (colore viola) possono essere presenti. Tipicamente, ci deve essere inferiore a una media di cinque punti per bene. I pozzi di controllo positivi confermano che la reazione è stata eseguita correttamente e che le cellule sono sensibili alla stimolazione antigenica. Nei pozzetti di controllo positivo che ci si aspetterebbe di vedere uno sfondo viola scuro a causa di una confluenza di macchie (Fig. 1). Ci dovrebbe essere poco o nessun sfondo bianco. Se il controllo positivo e negativo sono campioni di controllo adeguati, si può poi contare i pozzetti contenenti l'antigene di interesse. Un risultato "non ottimale" sarebbe riflessa dal fondo alto (i pozzi sono viola), senza punti o macchie molto pochi, il centro vuoto, macchie mal definiti o macchie confluenti. Una lista di suggerimenti per la risoluzione è previsto (tabella 1).

Figura 1. Un rappresentante della piastra ELISPOT. Ogni piastra deve contenere un controllo positivo, controllo negativo e peptidi di interesse condotto presso il minimo di due pozzi. C9, C10, D9 e D10 sono i pozzetti di controllo positivi, come potete vedere c'è un colore rosso porpora, le cellule confluenti e quasi nessuno sfondo bianco. I pozzi di controllo negativo sono G11, G12, H11 e H12. Questi pozzi non hanno sfondo viola e senza punti come previsto. I punti del G7, G8, H7 e H8, illustrare le risposte cellulari ai peptidi microbici; i punti viola rappresentano una singola cellula di risposta che esprime la citochina di interesse.

Tabella 1

Osservazione	Problema Possibile	Soluzione possibile
Sfondo ad alta	1. Entrambi i lati della membrana non lavate correttamente 2. Troppe cellule secernenti citochine 3. Piastra non secchi correttamente 4. Sulla piastra sviluppato	1. Lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata prima e dopo lo sviluppo del colore. Reagenti può fuoriuscire attraverso la membrana nella base del piatto, e questi possono causare elevato background se non lavato via. 2. Ridurre il numero di cellule per pozzetto, questo richiederà l'ottimizzazione 3. Secco il piatto più a lungo prima lettura 4. Ridurre i tempi di sviluppo
Senza punti / Spot Pochissime	1. Non abbastanza cellule secernenti citochine / proteine ​​di interesse 2. Assicurarsi che le cellule vengono stimolate correttamente 3. Cellule non incubate per long abbastanza o potrebbe richiedere del tempo per rispondere alla stimolante 4. Colore sviluppo inadeguato 5. Anticorpi non abbastanza primaria o secondaria	1. Aumentare il numero di cellule. Ciò richiederà l'ottimizzazione 2. Inoltre possibile utilizzare un controllo positivo stimolo - uno stimolante che sapete che inducono l'espressione di citochine vostro / proteine ​​di interesse 3. Aumentare il tempo di incubazione di cellule o di utilizzare il metodo indiretto (pre-trattamento di cellule con stimolanti) 4. Monitorare lo sviluppo del colore con un microscopio in testa e assicurarsi che i reagenti di sviluppo sono stati conservati correttamente e non hanno perso l'attività 5. Concentrazione dell'anticorpo primario e / o secondaria dovrà essere aumentato. Ciò richiede l'ottimizzazione.
Aree vuoto	1. Membrana non pre-trattati 2. Membrana si è asciugata in qualche fase 3. Cellule irregolarmente distribuite	1. Garantire membrana è adeguatamente pretrattati con etanolo al 70% (tutte le membrane non hanno bisogno di questo in modo da verificare con il fornitore). Lavare bene con PBS 3X dopo 2. Garantire membrana non si secchi 3. Assicurarsi di mescolare delicatamente le cellule di avere un buon omologo sospensione cellulare prima di pipettaggio fuori nei pozzetti
Centro vuoto	1. Danni derivanti dal lavaggio	1. Portata in lavaggio automatico (o pipette) potrebbe essere troppo alto. Hai bisogno di una procedura di lavaggio più delicato
Falsi Positivi	1. Aggregati anticorpo secondario 2. Cellule ancora sulla membrana 3. Coltura cellulare contaminazione	1. Filtrare l'anticorpo secondario 2. Assicurarsi che tutte le cellule sono lavate dalla membrana con PBS Tween 20 prima di incubazione anticorpo secondario. Cellule sinistra sulla membrana darà irregolari macchie a forma di 3. Mantenere i reagenti come sterile e pulito possibile. Garantire la vostra tecnica di coltura cellulare è asettico. Verificare la presenza di falsi positivi eseguendo un controllo negativo dei media. Per i movimenti delle griglie, vedere i punti mal definiti
Spot confluenti	1. Povero rivestimento, anticorpi troppo 2. Coltura cellulare prolungato 3. Cellule sovra-stimolata	1. Ridurre la concentrazione di anticorpi primari 2. Più a lungo le cellule sono incubate, più citochina / proteine ​​saranno secernono. Questo si tradurrà in grandi macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. 3. Ridurre il tempo di coltura cellulare fase di incubazione. Eccesso di stimolazione si tradurrà in un sacco di citochine / proteine ​​essere secreta dalla cellula. Questo produrrà macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. Ridurre la quantità di stimolanti nei terreni di coltura o di cultura per un periodo di tempo più breve
Spot mal definiti	1. Membrana non pre-trattati (se la membrana lo richiede, verificare con il fornitore) 2. Movimento piastra durante l'incubazione delle cellule	1. La membrana deve essere pre-trattati con etanolo o questo può portare a fuzzy, luoghi scarsamente definiti. Sarà difficile per il lettore a distinguere questi 2. Non lasciare che la piastra di muoversi durante l'incubazione delle cellule come le cellule che si sono trasferiti creerà più di un punto. Se possibile utilizzare un apposito incubatore che non sarà aperto durante l'incubazione. Non toccare la piastra dopo aver aggiunto le cellule
Positivo Pozzetti di controllo è basso	1. Sottosviluppo - può essere una conseguenza dell'uso di streptavidina-ALP e / o BCIP / NBT soluzioni che non sono stati portati a temperatura ambiente	1. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di aggiungere ai pozzetti
La densità dei punti rende difficile quantificarli	1. Troppe cellule sono stati aggiunti ai pozzetti	1. Diluire di cellule (cioè 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellule per pozzetto) per determinare il numero ottimale di cellule che si tradurrà in formazione di macchie distinte

Discussion

Il saggio ELISPOT è emerso come uno dei saggi più importanti e ampiamente utilizzati per monitorare le risposte immunitarie negli umani e una varietà di altre specie. Con il saggio ELISPOT, frequenze di cellule immunitarie può essere misurata a livello di singola cellula senza espansione o la manipolazione di popolazioni di cellule. Saggio ELISPOT è stato ampiamente applicato per indagare antigene risposta immunitaria specifica in varie malattie tra cui infezioni, tumori, allergie e malattie autoimmuni. L'applicazio...

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