$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Induzione e monitoraggio delle patologie cronico-recidivante EAE
L'emulsione è una miscela 1:1 di antigene in soluzione acquosa aggiunto integrato adiuvante completo di Freund. E 'molto importante aggiungere l'antigene per l'adiuvante e non viceversa!
Ci sono un sacco di rifiuti quando si effettua l'iniezione e una emulsione. Sempre preparare 1,5 o 2 volte più di quello che vi serve.
Usa mortaio in autoclave, pestello, siringhe di vetro, e ponti. Tutte le plastiche devono essere sterili. La preparazione può essere fatta su un banco di laboratorio regolare.
1. Preparazione del coadiuvante integrato
Pesare 30 mg di Mycobacterium tuberculosis (catalogo Difco # 231141) e posto in un mortaio. Fai in polvere sottile senza premere troppo per evitare di rompere i batteri. Aggiungere 10 ml di adiuvante completo di Freund H37Ra (Difco catalogo # 231131) e mescolare. Questo adiuvante integrato ora contiene 4 mg / ml di Mycobacterium tuberculosis. Trasferire in un tubo.
2. Preparazione del midollo spinale omogenato
Raccogliere midollo spinale di DA ratti (età / sesso indifferente) e conservare congelati a -80 ° C. Pesare i cavi congelato spinale di avere abbastanza da mix 1:1 (peso: volume) con l'adiuvante completati. Tritare il midollo spinale il più finemente possibile con una lama di rasoio, trasferimento in malta utilizzata nella sezione 1, e fare una pasta con il pestello.
3. Preparazione della emulsione
- Luogo integrato adiuvante completo di Freund in un tubo. Vortice ad alta velocità. Aggiungere il calo del midollo spinale omogenato a goccia, mentre vortex. Quando tutti i omogenato midollo spinale è aggiunto, vortex per 5 minuti. La miscela dovrebbe diventare rosa chiaro.
- Mettere l'emulsione in una siringa da 5 ml in vetro e collegarlo ad un altro siringa di vetro da 5 ml con un ponte di 18G (catalogo Fisher # 14-825-17L). Invia l'emulsione da una siringa all'altra fino a quando diventa difficile (5-10 minuti). Se più di 5 ml di emulsione è preparato, utilizzare diversi ml 5 siringhe NON usare più grandi siringhe.
- L'emulsione può essere memorizzato in siringhe a 4 ° C per 3 settimane. Raccomando prepararla almeno 12 ore in anticipo per verificare che non si rompe. Dovrebbe rimanere spessa e non separati in 2 fasi. Il colore cambia durante la notte per una luce gialla o beige.
4. Immunizzazione dei topi
- Mescolare l'emulsione nelle siringhe per qualche minuto e il trasferimento alla siringa usata per l'iniezione. Iniettare 200 ul per via sottocutanea alla base stessa della coda con aghi 23G e 3 ml siringhe Luer-Lock in breve anestesia.
- I destinatari sono 7-9 settimane di età ratti femmina DA. Riceviamo dal nostro Harlan ratti Sprague-Dawley.
- I ratti devono essere osservati due volte al giorno e pesati tutti i giorni. I segni clinici sono attesi 7-15 giorni dopo l'iniezione di emulsione.
Punteggio clinico:
0: nessuna malattia
0.5: distale coda zoppicare
1: coda zoppicare
2: paraparesi mite, atassia
3: paraparesi moderato, i viaggi ratti di volta in volta
3.5: un arto posteriore è paralizzato, l'altra si muove
4: completa paralisi degli arti posteriori
5: completa paralisi degli arti posteriori e incontinenza
6: moribondo, difficoltà a respirare, non mangiare o bere. Eutanasia immediatamente.