Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Sommario

Zebrafish è emersa come un potente In vivo per il fenotipo a base di schermi di droga e analisi chimica genetica. Qui, abbiamo dimostrato un metodo semplice e pratico per lo screening su larga scala di piccole molecole usando embrioni di zebrafish.

Abstract

Date le loro dimensioni embrione piccolo, rapido sviluppo, la trasparenza, la fecondità, e numerose somiglianze molecolari, morfologiche e fisiologiche per i mammiferi, zebrafish è emersa come un potente

Protocollo

1) Zebrafish Egg Collection

1. Nel pomeriggio prima del giorno dello schermo chimica, istituito 10-20 vasche di allevamento pesce zebra. Riempire ogni serbatoio con acqua dal sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete di pesce, il trasferimento di un maschio adulto e 1-2 femmine adulte di contenitore interno in ciascun serbatoio di allevamento. Separare i pesci di sesso maschile e femminile le une dalle altre con un divisore. Etichetta le gabbie e mettere un coperchio su di loro.
2. La mattina dello schermo, togliere i divisori da vasche di allevamento e permettere zebrafish per accoppiarsi. Nel corso del prossimo 1 ora, permettono uova fecondate di cadere in griglia nella parte inferiore di ogni contenitore interno.
3. Dopo 1 ora, il ritorno zebrafish adulto torna ai serbatoi di stoccaggio permanente, rimuovere il contenitore interno e raccogliere le uova da sforzare l'acqua di ogni vasca da riproduzione attraverso un colino da tè di plastica.
4. Invertire il filtro su una piastra di Petri e risciacquare il filtro delicatamente per lavare le uova nella scatola di Petri utilizzando una bottiglia di lavaggio contenenti il ​​mezzo E3.
5. Tutte le uova non fecondate, che appaiono opache, deve essere rimosso con una pipetta di plastica monouso. Ogni croce accoppiamento dovrebbe produrre circa 200 embrioni.

2) arraying Embrioni in piastre da 96 pozzetti

1. Trasferimento di circa 5 embrioni in media E3 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta Pasteur di vetro.
2. Una volta che gli embrioni sono disposti sulla piastra a 96 pozzetti, rimuovere tanto del mezzo E3 possibile fuori dei pozzi con una a 12 canali (30 - 300 mL) pipetta, facendo attenzione a non forare l'embrione. Utilizzando la pipetta a 12 canali, consegnare 250 microlitri di media E3 contenente kanamicina 0.5μg/ml in ogni pozzetto il più rapidamente possibile in modo da non permettere embrioni ad asciugarsi.
3. Mettere le piastre a 96 pozzetti in 28.5 ° C incubatore fino a raggiungere la fase desiderato quando i composti da aggiungere.

3) Trasferimento della Biblioteca piccole molecole

Mentre il trasferimento composto può essere automatizzato con metodi di trasferimento robotica, verrà descritto il metodo manuale di trasferimento.

1. Librerie di piccole molecole sono in genere forniti in un formato a 96 pozzetti, con ogni composto memorizzati in DMSO, secondo uno stock da 10 mm. Circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungere la fase in cui i composti sono da aggiungere, disgelo un numero desiderato di piastre a 96 pozzetti contenenti aliquote di piccole molecole (piatto di origine). Prendere nota del numero di identificazione di serie o altre piastre fonte. Per ridurre al minimo la condensazione sui piatti, scongelamento può avvenire in una camera di essiccazione contenente Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. In breve spin down i piatti in una centrifuga da tavolo dotato di multi-bene adattatore piastra.
3. Rimuovere il sigillo di alluminio dalla piastra fonte. Usando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra di origine alla concentrazione di 0,5 mm (per esempio, se partire con 250 aliquote nL 10 mM di brodo, aggiungere 4,75 ml di DMSO in ogni pozzetto).
4. Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti (piastra destinatario) raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare un 12-canale (2-20 mL) pipetta per trasferire 2.5μL di composti (0,5 mm), dalle piastre di origine nel recipiente contenente le piastre embrioni.
5. Registrare il numero di identificazione della fonte piatti su piatti embrione del destinatario. Copertura piastre destinatario che ora contiene gli embrioni e composti con coperchi dolcezza mescolare le piastre rimestando delicatamente e metterli in una 28.5 ° C Incubatore.
6. Coprire ogni piatto di origine che contiene inutilizzati piccole molecole (0,5 mm) con un nastro di tenuta in alluminio e mettere in un congelatore ° -80 C per la conservazione a lungo termine.

4) Lo screening per gli effetti di piccole molecole mediante ispezione visiva delle Fenotipi

1. Prima di eseguire lo schermo, formulare un criterio specifico per ciò che costituirebbe una "hit".
2. A volte desiderato in fase di sviluppo, rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti composto trattati con embrioni da incubatore ed esaminare ogni pozzetto sotto uno stereomicroscopio. Per una migliore visualizzazione dei cambiamenti sottili, come i cambiamenti nel modello circolatorio, un contrasto di fase microscopio invertito può essere utilizzato. Microscopia a fluorescenza può essere utilizzato per esaminare perturbazione di espressione di proteine ​​GFP o DsRed in un tessuto specifico promotore.
3. Analizzare rapidamente le piastre a 96 pozzetti per ogni bene in quali almeno 3 su 5 embrioni presentano le prescritte fenotipo "hit". Registrazione dell'identità della piastra e la posizione di ogni colpo ben potenziale.
4. Riconfermare un successo potenziale di ripetere le prove degli effetti del farmaco a dosaggi diversi (1 uM, 5 uM, 10 mM e 50 mM). Per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 ml di media E3 in un 48-ben formato piatto. I tempi di aggiunta composti per ripetere il test dovrebbe essere identica a quella della proiezione originale. Un colpo è confermata quando il fenotipo suscitato è riprodotto su una nuova determinazione della compound
5. Identificare il composto colpito dal database di piccole molecole in biblioteca chimica.

Discussione

Quando si pianifica un pesce zebra-based schermo chimica, particolare attenzione deve essere posta la robustezza del fenotipo in esame e il tasso di sfondo di tale fenotipo. Ciò è particolarmente importante per le schermate per soppressori chimica di un fenotipo indotto. Ad esempio, per un fenotipo causato da shock termico ad induzione di un transgene, la condizione che induce il fenotipo riproducibile deve essere tracciata con precisione prima di iniziare lo schermo per evitare i tassi di falsi positivi inaccettabilmen...

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