Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Summary

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in Ovociti di Xenopus Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.

Abstract

Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l'attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca ^{2 +-attivati} ​​K ⁺ (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori ^1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori ^2-6. BK canali sono attivati ​​da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca ^{2 +} e Mg ^{2 + 6-9.} Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l'RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C ^10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l'inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp ^10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l'attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l'mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine ​​canale sulla membrana dell'ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.

Protocol

1. L'iniezione di mRNA in oociti

1. Iniettare ,05-50 ng di RNA messaggero che è stato trascritto in vitro in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI) con Nanoject II Auto-nanoliter Injector (Drummond società Scientific, modello 3-000-204). Ripetere l'iniezione su una decina di ovociti per ogni mRNA.
2. Risciacquare gli ovociti iniettati due volte usando ND-96 soluzione (96 mM di cloruro di sodio (NaCl, il signor 58,44 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, il signor 74,56 g / mol), 1,8 mM di cloruro di calcio (CaCl ₂ • 2H ₂ O , il signor 147,02), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, il signor 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, il signor 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato di sodio (il signor 110,04 g / mol) e 1x penicillina-streptomicina. pH 7,6), poi mettetele in una piastra di coltura e incubare a 18 ° C per 2 giorni +.

2. Preparazione del sistema di perfusione

Illustrazione del ValveLink Automatizzare 16 Sistema di perfusione. Il sistema di perfusione utilizza l'azoto pressurizzato per spingere soluzioni di perfusione fuori dei serbatoi soluzione, attraverso i tubi di perfusione, e la matita perfusione e mancia escluse. Il flusso di ogni flusso della soluzione di perfusione è controllato da una valvola serbatoio e una valvola elettronica. In questo protocollo, uno dei serbatoi non è pressurizzato e funziona come un raccoglitore così come un meccanismo di rilascio della pressione. (Foto adattato da http://www.autom8.com sito venditore)

1. Collegare i tubi alla matita perfusione. Accendere il controller valvola elettronica e aprire le valvole elettroniche.
2. Per garantire che i tubi e la matita perfusione sono liberi di bolle d'aria e di intasare, spingere deionizzata (DI) attraverso ogni tubo usando una siringa riempita con acqua deionizzata.
3. Collegare i tubi ai serbatoi soluzione e aprire la valvola della bombola di gas da applicare azoto pressurizzato.
4. Aprire il rubinetto serbatoio per riempire il tubo con la soluzione di riserva. Flick la valvola serbatoio per rimuovere le bolle nella soluzione, se necessario. Chiudere la valvola dopo che il tubo è riempito di soluzione.
5. Riempire la punta perfusione con acqua e avvitarlo sulla matita perfusione. Fare attenzione a non intrappolare le bolle quando si collega la punta.
6. Fissare la matita perfusione allo stadio bagno con plastilina. Assicurarsi che la punta perfusione è in bagno. Il sistema di perfusione è ora impostato.
7. Aggiungere acqua deionizzata nella vasca da bagno. Assicurarsi che la punta perfusione è sommerso in acqua.
8. Prova che ogni soluzione perfusione esce dalla punta perfusione correttamente. Chiudere la valvola elettronica collegata al tubo di raccolta dei rifiuti e aprire la valvola per una soluzione di perfusione alla volta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil) -1 - piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM di potassio cloruro (KCl, M _r 74,56 g / mol), 1 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetracetico acido (EGTA, M _r 380,35 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO _3, M _r 96,1 g / mol), Ca ^{2 +} e Mg2 + viene aggiunto alla concentrazione desiderata quando necessario). Sotto il microscopio, osservare il getto di liquido di perfusione che esce dalla punta di perfusione. Chiudere la valvola per la soluzione di perfusione e aprire la valvola per la raccolta dei rifiuti. Il getto perfusione dovrebbe quasi scomparire. Ripetere la stessa prova per tutte le soluzioni di perfusione.
9. Quando hai verificato che tutte le soluzioni di flusso di perfusione correttamente, sostituire acqua distillata nella vasca da bagno con la soluzione (140 mM idrossido di potassio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM cloruro di potassio (KCl, M _r 74,56 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO _3, M _r 96,1 g / mol)).

3. Patch di serraggio

1. Ricopertura l'elettrodo di registrazione Ag con AgCl prima di ogni patch di serraggio sessione. In primo luogo, rimuovere il filo elettrodo dal titolare pipetta e immergere la metà punta del filo elettrodo in un flacone di candeggina fresca per almeno 15 minuti. Questo depositi uno strato di AgCl sul filo.
2. Sciacquare il filo elettrodo con acqua deionizzata e asciugare. Quindi installare l'Ag / AgCl indietro nel supporto pipetta.
3. Collegare il (di riferimento) elettrodo bagno al headstage e posizionarlo nella vasca da bagno. Questo prepara gli elettrodi per la registrazione.
4. Ora preparate per l'acquisizione dei dati. Accendere il computer e inserire la chiave hardware alla porta stampante del computer. La chiave hardware deve essere collegato per poter utilizzare il software di acquisizione dati, che è HEKA impulsi.
5. Accendere l'amplificatore (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) e iniziare a HEKA Pulse. Caricare il file di protocollo e regolare le impostazioni di configurazione, come la Scala di stimolo. L'obiettivo per regolare le impostazioni di configurazione è di assicurare che il potenziale di test è esattamente uguale al potenziale di comando. Questo prepara le apparecchiature di acquisizione dati.
6. Preparare ovociti. Immergere l'ovocita in soluzione stripping (200 mm N-Metil-D-glucamine (NMG, M _r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (senza K ⁺⁾ (M _r 133,1 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl , M _r 74,56 g / mol), 10 mM glicol etilenico-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetracetico acido (EGTA, M _r 380,35 g / mol), 1 mM di cloruro di magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), 10 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), pH viene regolato a 7,4 con idrossido di sodio (NaOH, M _r 40,0 g / mol) per 5 - 10 min. La soluzione stripping stacca la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile mettere a nudo la membrana vitellina.
7. Delicatamente la striscia di membrana vitellina da ovocita usando due paia di pinzette. Un ovocita devitellinized è estremamente fragile e quindi deve essere spostato il meno necessario.
8. Avendo cura di evitare di esporre l'ovocita devitellinized a bolle d'aria o, usare una pipetta di vetro riempita con una soluzione sufficiente per trasferire l'ovocita al bagno. Questo prepara l'ovocita per la registrazione.
9. Preparare pipette patch. Tirare le pipette di vetro dopo aver inserito un tubo capillare di vetro (VWR International, Cat # 53432-921) in una Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipetta Puller. Osservare le pipette al microscopio per determinare la forma della punta e diametro di apertura. Il diametro di apertura dovrebbe essere di 2-4 micrometri.
10. Per ridurre la corrente capacitiva durante la registrazione e per garantire una punta liscia, cappotto la punta con la cera e poi il fuoco-polacco.
11. Riempire la punta della pipetta posizionando la punta della pipetta all'interno della soluzione di pipetta (140 mM idrossido di potassio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM di cloruro di potassio (KCl, M _r 74,56 g / mol), 2 mM cloruro di magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), il pH è regolato da 7,1-7,2 metansolfonico acido (MESO _3, M _r 96,1 g / mol)) e il disegno lo stantuffo. Questo bagna la punta.
12. Riempire la pipetta 1 / 3 pieno con una soluzione pipetta usando una siringa e inserire la pipetta nel supporto pipetta con l'Ag / AgCl all'interno elettrodo e contatto con la soluzione di pipetta. Questo prepara la pipetta di patch.
13. Per accise uno inside-out patch dal ovocita preparato, trovare il chiaro vantaggio di ovociti al microscopio. Spostare la pipetta di patch vicino al ovociti mediante manipolatore. Registrare la resistenza di serie pipetta. La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno.
14. Spingere lentamente la pipetta contro l'ovocita fino a quando la resistenza raddoppia.
15. Applicare aspirazione delicato per la membrana per via orale attraverso un tubo di aspirazione che è collegato al titolare pipetta fino a quando un giga ohm sigillo è ottenuto. Stabilizzare la patch tenendolo in tensione -30 mV per un paio di minuti.
16. Per ottenere un inside-out patch, la patch da accise rapidamente spingendo la pipetta ulteriormente nel citoplasma dell'ovocita e poi delicatamente tirando fuori.
17. L'inside-out patch è ora pronto per il bloccaggio. Spostare la pipetta tenendo la inside-out patch per circa 100 micron di distanza dall'apertura della punta perfusione.
18. Chiudere la valvola elettronica per la raccolta dei rifiuti e aprire la valvola serbatoio per la soluzione di perfusione desiderato
19. Iniziare a registrare le correnti attraverso la patch. Modificare le soluzioni di tensione e perfusione come desiderato.
20. Quando si è finito di registrare, pulire la perfusione tubi, matita e punta spingendo attraverso l'acqua deionizzata per evitare intasamenti.

4. Rappresentante Risultati

Durante la preparazione di ovociti per la patch clamp, il trattamento 5-10 min di soluzione stripping sarebbe staccare la membrana vitellina dalla membrana plasmatica, che rende possibile togliere la membrana vitellina.

La resistenza serie ideale della pipetta patch è tra 1-1,5 MΩ quando è riempita con una soluzione di pipetta e immersi in una soluzione da bagno.

Che segue è una registrazione rappresentante della wild-type canali BK su una patch di membrana dell'ovocita. In alto a sinistra, le onde quadre indicano la tensione applicata la patch - il secondo passo di aumenti di tensione da 50 mV a 200 mV con incrementi di 50 mV. Di seguito le tracce corrispondente corrente quando la soluzione di perfusione è nominale 0 Ca ^{2 +} (libero [Ca ^{2 +]} è di circa 0,5 nM). L'apiega di ampiezza della corrente indica che la probabilità di apertura dei canali BK aumenta con la tensione. Sul lato destro, la stessa patch è perfuso con 1.0 mM Ca ^{2 +} quando è applicato con il protocollo stessa tensione. L'ampiezza della corrente aumenta di più sotto la stessa tensione, indicando che la probabilità aumenta con l'aperta [Ca ^{2 +].}

Discussion

Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazioni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanoject II Iniettore Auto-Nanolitro	Drummond Scientific	3-000-204
P-97 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Sutter Instrument Co.	P-97
e controller elettronico	AutoMate Scientific, Inc.	ValveLink 16	Diametro interno della punta di perfusione: 100 micron
Microscopio invertito	Olympus Corporation	CKX31
Pipette in vetro	VWR international	53432-921
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Sutter Instrument Co.	P-97
Amplificatore	Axon Instruments	AXOPATCH 200B
Interfaccia computer	INSTRUTECH Corporation	ITC-18
Headstage	Axon Instruments	CV 203BU