Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione di Candida albicans Biofilm su 96 micropiastre bene e la sua utilità nei test di suscettibilità antifungina di cellule all'interno di biofilm.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm
In questo articolo
Sommario
Abstract
Candida albicans rimane la causa più frequente di infezioni fungine in una popolazione in espansione di pazienti compromessi e candidosi è ora la terza più comune infezione negli ospedali degli Stati Uniti. Diverse manifestazioni della candidiasi sono associati con la formazione di biofilm, sia su tessuti dell'ospite e / o dispositivi medici (cateteri per esempio). Formazione di biofilm svolge negative implicazioni cliniche, come le cellule all'interno del biofilm sono protetti dalla risposta immunitaria e dall'azione di antimicotici. Abbiamo sviluppato un modello semplice, veloce e robusto in vitro per la formazione di C. biofilm albicans con 96 pozzetti per microtitolazione piastre, che può anche essere utilizzato per test di suscettibilità biofilm antimicotico. La lettura di questo saggio è colorimetrico, basato sulla riduzione delle XTT (un sale di tetrazolio) da cellule metabolicamente attive biofilm fungine. Un tipico esperimento dura circa 24 ore per la formazione di biofilm, con ulteriori 24 ore per i test di suscettibilità antifungina. A causa della sua semplicità e l'utilizzo di materiali di laboratorio e attrezzature comunemente disponibili, questa tecnica democratizza ricerca biofilm e rappresenta un passo importante verso la standardizzazione dei test di suscettibilità antifungina di biofilm fungine.
Protocollo
1. Preparazione di C. albicans
C. albicans è un microrganismo Group Risk 1/BSL1. Ricordate sempre di usare buone tecniche asettiche / sterile per lavorare con questo microrganismo e seguire le procedure istituzionali per il corretto smaltimento dei materiali a rischio biologico.
- Preparare una cultura durante la notte di C. albicans in YPD (Lievito peptone destrosio) mezzo liquido inoculando una singola colonia di C. albicans in 25 ml di YPD.
- Incubare cultura in un agitatore orbitale (circa 180 giri al minuto) a 30 ° C durante la notte. La maggior parte C. albicans ceppi cre....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui si descrive un semplice, rapido, economico e altamente riproducibili 96 pozzetti modello micropiastre per la formazione di biofilm Candida accoppiato con un metodo colorimetrico che misura l'attività metabolica delle cellule all'interno del biofilm utilizzando XTT. Questo modello ben 96 micropiastre per la formazione di biofilm è stato originariamente sviluppato per C. albicans ma può essere utilizzato per altre Candida spp. e facilmente adattato per altri organismi fungini. Il met.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
JLL-R possiede partecipazioni in MicrobeHTS Technologies, Inc., che sta sviluppando agenti antifungini. MicrobeHTS Technologies, Inc. ha fornito alcun supporto finanziario per questi studi.
Ringraziamenti
Biofilm attività relative al laboratorio è finanziata da sovvenzioni numerati R21DE017294 e R21AI080930 dal National Institute of Dental Research & cranio-facciali e l'Istituto nazionale per le allergie e malattie infettive (a JLL-R.). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIDCR, il NIAID o il NIH.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar Sabouraud-dextrosio | BD Biosciences | 211584 | Per preparare piastre per subcolture fresche di isolati fungini |
| YPD: peptone di lievito con dextrosio | US Biological | Y2076 | Mezzo per la propagazione di colture liquide notturne |
| RPMI-1640 senza bicarbonato di sodio, integrato con L-glutammina | Cellgro | 50-020-PB | Mezzo liquido per la formazione di biofilm |
| Acido morfolinopropanosolfonico (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Per tamponare l'RPMI 1640 |
| Soluzione salina tamponata al fosfato, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Tampone per lavaggi |
| Sale sodico di XTT | Sigma-Aldrich | X4251 | Vedi sopra per le istruzioni di preparazione |
| Lattato di Ringer’s | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Per la preparazione della soluzione di XTT |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Attenzione: pericoloso per contatto cutaneo, inalazione o ingestione |
| Piastre di Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Provette coniche da 15 ml per centrifuga | Corning | 430790 | |
| Provette coniche da 50 ml per centrifuga | Corning | 430828 | |
| Piastre microtitolazione a 96 pozzetti: in polistirene, fondo piatto, trattate per colture cellulari | Corning | 3595 | |
| Pipetta multicanale e punte | Eppendorf | ||
| Incubatrice | Qualsiasi fornitore | ||
| Lettore per piastre microtitolazione | Qualsiasi fornitore |
Riferimenti
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
