Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali

Summary

Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.

Abstract

Staminali embrionali (ES), le cellule sono cellule pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti, stadio embrioni precoci di mammifero ^1. Una fase cruciale nella differenziazione delle cellule staminali embrionali è la formazione di corpi embrionali (EBS) aggregati ^{2, 3.} Formazione di EB è basato su aggregazione spontanea quando le cellule ES sono coltivate in piastre non aderente. Tridimensionale ricapitola EB molti aspetti dei primi embriogenesi dei mammiferi e di differenziarsi nei tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma ed endoderma ^4.

Immunofluorescenza e ibridazione in situ sono ampiamente utilizzate tecniche per la rilevazione di proteine ​​bersaglio e di mRNA presenti nelle cellule di una sezione di tessuto ^{5, 6, 7.} Qui vi presentiamo una semplice tecnica per generare criosezioni alta qualità dei corpi embrionali. Questo approccio si basa su l'orientamento spaziale di incorporare EB in ottobre seguita dalla tecnica cryosection. Le sezioni risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per caratterizzare popolazioni di cellule che contengono alcune proteine, RNA o DNA. In questo senso, la preparazione di criosezioni EB (10μm) sono strumenti essenziali per l'analisi colorazione istologia (ad esempio Hematoxilin e eosina, DAPI), immunofluorescenza (ad esempio Oct4, nestina) o ibridazione in situ. Questa tecnica può anche aiutare a capire gli aspetti della embriogenesi per quanto riguarda il mantenimento del tri-dimensionale struttura sferica di EBS.

Protocol

1. Fissazione e Crioconservazione

Cellule staminali pluripotenti sono state coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) inattivato con mitomicina C e mantenuti in DMEM/F12 integrato con la sostituzione ad eliminazione diretta il 20% siero (KSR) e 8ng / mL di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2). Al fine di indurre la formazione di EB cellule H9 sono stati trasferiti a non aderente piatti e coltura per 7 giorni, mantenuti in DMEM/F12 integrato con il 15% KSR ^8.

Nota (!): Questa tecnica può essere usata per EB derivato da cellule pluripotenti indotte embrionali e staminali.

1. Raccogliere l'....

Discussion

Il metodo qui descritto fornisce un facile da seguire il protocollo di ottenere PFA fisso criostato sezioni sottili di corpi embrionali utili per immunofluorescenza e saggi di ibridazione in situ. Il criosezioni risultante permesso lo studio degli aspetti cellulari e molecolari del differenziamento delle cellule staminali embrionali umane, pur mantenendo la loro struttura e organizzazione come aggregati.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Reagente Saccarosio		Vetec	228
Reagente	Paraformaldeide	Rieden-de Haë n	16005
Soluzione PBS	Reagente	LGC Biotecnology	13-30259.05
Poli-L-lisina bromidrato	Reagente	Sigma-Aldrich	P2636	200mg/mL in acqua
Tissue-Tek O.C.T. Reagente composto		Sakura Finetek	P2636
Soluzione di saccarosio	Reagente			10% Soluzione di saccarosio in PBS w/v
Reagente			soluzione di saccarosio	saccarosio al 20% in PBS con
reagente			in soluzione di saccarosio	al 30% in PBS con
strumento per tubi conici		Prodotti in tecnoplastica	91015	Tubo conico da 15 ml
Strumento per scuotitore a piastre	Strumento	per
		Leica Microsystems	CM 1850
Stampo per piattaforma OCT	Utensile			Stampo in plastica plataform