Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.
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Articolo metodologico
Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Staminali embrionali (ES), le cellule sono cellule pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti, stadio embrioni precoci di mammifero 1. Una fase cruciale nella differenziazione delle cellule staminali embrionali è la formazione di corpi embrionali (EBS) aggregati 2, 3. Formazione di EB è basato su aggregazione spontanea quando le cellule ES sono coltivate in piastre non aderente. Tridimensionale ricapitola EB molti aspetti dei primi embriogenesi dei mammiferi e di differenziarsi nei tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma ed endoderma 4.
Immunofluorescenza e ibridazione in situ sono ampiamente utilizzate tecniche per la rilevazione di proteine bersaglio e di mRNA presenti nelle cellule di una sezione di tessuto 5, 6, 7. Qui vi presentiamo una semplice tecnica per generare criosezioni alta qualità dei corpi embrionali. Questo approccio si basa su l'orientamento spaziale di incorporare EB in ottobre seguita dalla tecnica cryosection. Le sezioni risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per caratterizzare popolazioni di cellule che contengono alcune proteine, RNA o DNA. In questo senso, la preparazione di criosezioni EB (10μm) sono strumenti essenziali per l'analisi colorazione istologia (ad esempio Hematoxilin e eosina, DAPI), immunofluorescenza (ad esempio Oct4, nestina) o ibridazione in situ. Questa tecnica può anche aiutare a capire gli aspetti della embriogenesi per quanto riguarda il mantenimento del tri-dimensionale struttura sferica di EBS.
Protocollo
1. Fissazione e Crioconservazione
Cellule staminali pluripotenti sono state coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) inattivato con mitomicina C e mantenuti in DMEM/F12 integrato con la sostituzione ad eliminazione diretta il 20% siero (KSR) e 8ng / mL di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2). Al fine di indurre la formazione di EB cellule H9 sono stati trasferiti a non aderente piatti e coltura per 7 giorni, mantenuti in DMEM/F12 integrato con il 15% KSR 8.
Nota (!): Questa tecnica può essere usata per EB derivato da cellule pluripotenti indotte embrionali e staminali.
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Discussione
Il metodo qui descritto fornisce un facile da seguire il protocollo di ottenere PFA fisso criostato sezioni sottili di corpi embrionali utili per immunofluorescenza e saggi di ibridazione in situ. Il criosezioni risultante permesso lo studio degli aspetti cellulari e molecolari del differenziamento delle cellule staminali embrionali umane, pur mantenendo la loro struttura e organizzazione come aggregati.
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo uno Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Siamo grati a S. Bruna Paulsen e Aline M. Fernandes per le immagini EB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Saccarosio D (+) | Reagente | Vetec | 228 | |
| Paraformaldeide | Reagente | Rieden-de Haën | 16005 | |
| Soluzione PBS | Reagente | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Idrobromuro di poli-L-lisina | Reagente | Sigma-Aldrich | P2636 | 200 mg/mL in acqua |
| Composto Tissue-Tek O.C.T. | Reagente | Sakura Finetek | P2636 | |
| Soluzione di saccarosio | Reagente | Soluzione di saccarosio al 10% in PBS, p/v | ||
| Soluzione di saccarosio | Reagente | Soluzione di saccarosio al 20% in PBS, p/v | ||
| Soluzione di saccarosio | Reagente | Soluzione di saccarosio al 30% in PBS, p/v | ||
| Tubo conico | Strumento | Techno Plastic Products | 91015 | Tubo conico da 15 mL |
| Agitatore a piatto | Strumento | Biomixer | ||
| Criostato | Strumento | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Stampo per piattaforma OCT | Strumento | Stampo in plastica per piattaforma |
Riferimenti
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N.
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Ristampe e permessi
