Somministrazione virale mirata ai neuroni corticospinale in un ratto neonatale per studiare la lesione del midollo spinale

Abstract

Fonte: Smit, R. D., et al. Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un doppio vettore virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la somministrazione mirata di vettori virali ai neuroni corticospinali in un ratto neonatale. Il protocollo consente un'espressione genica precisa utilizzando iniezioni virali anterograde e retrograde, facilitando la ricerca sulla rigenerazione neurale e sulla plasticità dopo una lesione del midollo spinale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezioni dirette nel midollo spinale mirate ai terminali degli assoni

1. Utilizzando la punta dell'ago per iniezione in vetro, approssimare la linea mediana del midollo spinale identificando l'arteria spinale. Tuttavia, se l'arteria spinale è notevolmente decentrata o devia in qualsiasi modo, approssimare la linea mediana utilizzando la posizione del processo spinoso C2 ed estrapolandola lungo la lunghezza della colonna vertebrale.
   NOTA: Caricare il virus nell'iniettore pipettando ~5 μL su un pezzo di parafilm e posizionare l'ago in modo che la punta poggi sopra la gocciolina virale.
2. Una volta identificato, posizionare l'ago appena dietro la lamina C5 alla linea mediana approssimativa e usarla come punto di riferimento. Quindi, utilizzando il micromanipolatore, spostare l'ago lateralmente verso destra di 0,3 mm. Abbassare l'ago fino a toccare appena la superficie del midollo spinale; Da questa profondità, immergere l'ago di 0,6 mm nel midollo spinale. Se necessario, continuare a immergere l'ago fino a perforare il midollo spinale; Quindi, ritrarre o abbassare l'ago alla profondità appropriata.
3. Iniettare 1 μL di virus retroadeno-associato2-scCre a 250 nL/min. Al termine dell'iniezione, attendere 2 minuti affinché il virus si diffonda nel midollo spinale prima di ritirare lentamente l'ago. Ripetere le iniezioni utilizzando le stesse coordinate laterali e di profondità in altri due siti all'interno della finestra spinale, uno nel punto medio e l'ultimo appena anteriormente alla lamina T1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	Per pulire gli aghi di vetro e caricare l'olio rosso negli aghi di vetro.
Tubi capillari in vetro	World Precision Instruments	4878	Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri.
Micromanipolatore con scala a corsoio	Kanetec	N/A	Per un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico.
Strumento stereotassico standard da laboratorio	Stoelting	51600	Per tenere in posizione il supporto sterotassico neonatale
Lab Standard con adattatore per topi e neonati 51615 Per la fissazione del cranio neonatale durante la chirurgia cranica e le iniezioni spinali Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare Leitz Wetzlar N/A
			Utilizzato per visualizzare e misurare la smussatura di tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali.
Controller per pompe a microsiringa	World Precision Instruments	62403	Per controllare la velocità di iniezione.
Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000	World Precision Instruments	500150	Per caricare e iniettare virus in modo controllato.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		plasmide
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmide #44361)	Il laboratorio di Bryan Roth attraverso Addgene		DREADD plasmide
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale.
Pinze per denti di ratto	Roboz	RS-5152	Per la presa di processi spinosi.
Soluzione salina sterile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico.
Guanti chirurgici	N/A	N/A	Per l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico.
Cuscinetto riscaldante chirurgico	N/A	N/A	Per mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico.
Microscopio operatorio	N/A	N/A	Per una migliore visualizzazione della ferita chirurgica.

Cre