Impianto di una sonda biocompatibile flessibile in un modello murino di glioblastoma

Abstract

Fonte: Lefevre, M. C., et al., Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra l'impianto di una sonda flessibile e biocompatibile in un modello murino di glioblastoma per fornire una terapia mirata con campo elettrico pulsato per applicazioni neuroterapeutiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Il modello in vivo
   NOTA: Topi adulti multicolore fluorescenti AMU-Neuroinflam (B6. Sono stati utilizzati Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); questi topi presentano la marcatura di una sottopopolazione di neuroni Thy1⁺ mediante l'espressione transgenica di ECFP, la marcatura di cellule infiammatorie periferiche LyzM⁺ mediante l'espressione transgenica di EGFP e la marcatura di un sottotipo di microglia che esprime EYFP sotto il controllo di Cd11c⁺. In breve, gli animali vengono leggermente sedati con isoflurano all'1,5% per 2 minuti prima di qualsiasi trattamento o iniezione. Prima dell'intervento, gli animali vengono anestetizzati con ketamina (120 mg/kg; IP) e xilazina (12 mg/kg; IP). Quindi, il gel di lidocaina al 3% viene applicato localmente per alleviare qualsiasi dolore alle orecchie associato alla fissazione del supporto stereotassico. Quindi, una soluzione di bupivacaina allo 0,25% viene somministrata al sito chirurgico per alleviare il dolore dovuto alla craniotomia. Una volta che il topo è stato preparato per l'intervento chirurgico, è stata eseguita una craniotomia di 4 mm di diametro. Con un ago da 26 G, è stato praticato un foro nella dura madre al centro della craniotomia e lo sferoide tumorale è stato iniettato con il sistema di iniezione. Inoltre, come descritto qui, un elettrodo flessibile è stato posizionato sullo sferoide tumorale che esprime GCamp6 o DsRed prima di sigillare la craniotomia con una finestra di vetro.
   1. Posiziona una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) in modo che copra la craniotomia. Posizionare l'elettrodo flessibile sulla goccia di DPBS e posizionare delicatamente la parte posteriore della sonda con i cuscinetti di contatto sulla parte posteriore del mouse (Figura 1B).
      NOTA: Utilizzare guanti sterili e una tecnica "solo punta". Cambiare i guanti se viene a contatto con una superficie non sterile. Fornire supporto termico durante questa procedura.
   2. Toccare la goccia DPBS con un piccolo pezzo di carta per assorbire DPBS fino a quando la sonda non può appoggiarsi sulla dura madre e seguire la curvatura del cervello. Assicurarsi che un piccolo strato di DPBS rimanga sotto gli elettrodi senza fuoriuscire dal lato dell'elettrodo. Ciò garantisce una barriera contro la fuoriuscita di colla durante i passaggi successivi.
      NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso.
   3. Posizionare una piccola goccia di adesivo siliconico sulla sonda e coprirla con un vetro di copertura rotondo da 5 mm. Spingere il vetro di copertura verso il basso fino a quando il silicone non è distribuito uniformemente e la distanza tra il vetro di copertura e la sonda è minima. Spingere il vetro di copertura verso il basso per altri 30 secondi in modo che il silicone possa solidificarsi.
   4. Per fissare il vetro di copertura, applicare rapidamente la supercolla sui lati e spingerla verso il basso fino a quando la colla non si asciuga fino a diventare solida.
   5. Usando uno stuzzicadenti, applica la supercolla sul collo della sonda, facendo attenzione che la supercolla venga aspirata sotto il collo per fornire un supporto stabile per essa.
   6. Copri il cranio con cemento dentale per costruire un tappo cronico. Prestare particolare attenzione a coprire solo i bordi del vetro di copertura.
   7. Sollevare la parte posteriore della sonda e applicare il cemento sotto il collo. Appoggiare la sonda sul cemento prima che si indurisca. Spingere delicatamente verso il basso il collo della sonda con una pinza smussata in modo che la sua superficie sia allo stesso livello di quella del vetro di copertura e non intralci l'obiettivo del microscopio durante l'esperimento.
   8. Coprire la parte superiore del collo della sonda con non più di 1,5 mm di strato di cemento dentale per ottenere una presa salda sulla sonda. Costruire un pozzo di cemento che presenti una cresta di 1,5 mm a una distanza di 1-2 mm attorno al vetro di copertura per creare una vasca per il fluido di immersione per l'imaging a due fotoni (Figura 1C).
   9. Dopo che il cemento si è indurito, applicare analgesici post-chirurgici alla buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,1 ml per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea) e mantenere l'animale in un'atmosfera calda fino al risveglio. Ciò include la vicinanza a una lampadina a infrarossi e l'avvolgimento dell'animale in un tovagliolo di carta.
      NOTA: Posizionare un termometro all'altezza del mouse per monitorare la temperatura.
   10. Caratterizzare l'impedenza nell'intervallo 1-10 kHz utilizzando un potenziostato.
   11. Lasciare che l'animale si riprenda dall'intervento chirurgico per almeno 10 giorni. Somministrare farmaci antinfiammatori subito dopo l'intervento chirurgico e continuare a monitorare lo stato dell'animale per fornire un'appropriata analgesia post-operatoria.

Risultati

Figura 1: L'applicazione in vivo. (A) Schema per esperimenti in vivo. (B) Posizionamento della sonda prima dell'applicazione del vetro di copertura e della resina acrilica. (C) Impianto della ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Resina acrilica	Fischer scientific	NC1455685
Buprenorphine	Axience
Lab ha realizzato un generatore
Penicillina / Streptomicina	Gibco	15140-122
Soluzione salina tampone fosfato	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Vetro di copertura rotondo diametro 5 mm	Fischer scientific	50-949-439
Adesivo siliconico Kwik-Sil	World Precision Instruments
Super colla	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14	Cellule di glioblastoma umano

di impulsi