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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
- Preparazione della siringa per microiniezione e del microiniettore per l'iniezione:
- Bloccare ogni siringa per microiniezione a tenuta di gas nel rack della pompa per microiniezione.
- Posizionare la punta della siringa a tenuta di gas nell'acqua sterile contenuta in una piccola navicella di pesatura e agitare delicatamente lo stantuffo per lubrificare il filo interno. Tirare uniformemente lo stantuffo fino all'arresto posteriore della pompa per riempirlo d'acqua.
- Far scorrere il tubo PE20 collegato al microiniettore su un ago da 26 G (mozzo marrone) collegato a una siringa da 1 ml riempita con acqua sterile. Spruzzare acqua sterile attraverso il microiniettore e ispezionare il ventaglio di spruzzatura e la distanza.
NOTA: L'acqua dovrebbe spruzzare molto lontano e direttamente dalla punta del microiniettore. Se il flusso non è rettilineo, la posizione di iniezione non sarà corretta. - Posizionare il microiniettore sterilizzato su un campo sterile.
- Far scorrere il tubo fuori dall'ago, mantenendo il tubo del microiniettore in posizione verticale per evitare che l'acqua goccioli e tagliando anche il tubo sotto l'area danneggiata dall'ago.
- Spingere leggermente in avanti lo stantuffo della siringa per microiniezione per creare una gocciolina all'estremità dell'ago e far scorrere il tubo PE20 riempito d'acqua (che è collegato al microiniettore) sull'ago.
NOTA: Questo creerà una connessione liquido-liquido che consentirà un'adeguata contropressione che potrebbe rimuovere un intasamento che potrebbe formarsi sulla punta del microiniettore. - Spingere lo stantuffo completamente in avanti per prepararsi al caricamento del campione e assicurarsi che non rimangano tracce di etanolo nel microiniettore.
- Controllare la configurazione per perdite toccando più volte la goccia d'acqua che si è formata sulla punta del microiniettore con una salvietta da laboratorio pulita.
- NOTA: Quando si tocca la salvietta da laboratorio, dovrebbe formarsi solo una macchia bagnata. Se ci sono più gocce, c'è una perdita nel sistema.
- Evitare perdite controllando l'applicazione della super colla e tagliando il tubo PE20 con forbici affilate o una lama di rasoio ogni volta che il tubo PE20 viene rimosso da qualsiasi collegamento.
- Tirare indietro lo stantuffo della siringa di 0,2 μl, creando una bolla tra l'acqua sterile nel tubo PE20/microiniettore e la soluzione da iniettare.
- NOTA: Questa bolla impedisce la diluizione dell'iniettato, la contaminazione dell'acqua e consente il monitoraggio del processo di iniezione poiché si muoverà durante l'iniezione. Dovrebbe essere prodotta una singola bolla solida.
- Posizionare il microiniettore nel reagente da iniettare e tirare lentamente lo stantuffo della siringa fino all'arresto posteriore.
- Preparazione di un animale per l'iniezione:
- Tieni il petto del topo contro il petto dello sperimentatore. Pulire l'area intorno alle cannule con un applicatore di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v/v).
- NOTA: Con una corretta manipolazione, i topi possono essere trattenuti delicatamente con una mano a coppa. In caso contrario, potrebbe essere necessario lo scruffing.
- Rimuovere gli otturatori utilizzando una piccola pinza e inserirli nella pesa con etanolo al 70% (v/v).
- Esecuzione delle iniezioni:
- Posizionare il microiniettore riempito nella cannula. Premere start sulla pompa di microiniezione e monitorare il movimento delle bolle.
- NOTA: Potrebbe essere necessario applicare una leggera pressione per garantire che i microiniettori non si sollevino. La bolla dovrebbe avanzare uniformemente ed entrare completamente nel microiniettore.
- Rimuovere i microiniettori dalla cannula e sostituire gli otturatori, una volta completata l'iniezione e trascorso il periodo di diffusione post-iniezione.
- NOTA: I tempi tipici di diffusione post-iniezione sono di 2-4 minuti per i reagenti farmacologici e di 2-10 minuti per i virus. Lasciare il microiniettore durante il periodo post-infusione impedisce all'iniettato di rifluire lungo le cannule piuttosto che diffondersi nel tessuto. Posizionare gli otturatori sul lato della navicella di pesa riempita di etanolo per consentire all'etanolo di defluire prima di reinserirlo nella cannula.