Trapianto di progenitori neuronali derivati da cellule staminali in fette corticali umane

Abstract

Fonte: Palma-Tortosa, S., et.al. Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il trapianto di cellule progenitrici neuronali derivate da cellule staminali in fette di tessuto corticale umano. La procedura prevede l'isolamento e la risospensione delle cellule progenitrici in una matrice di membrana basale, seguita dalla loro iniezione in una fetta corticale posta su un assemblaggio transwell. Dopo l'incubazione per consentire la solidificazione della matrice e la differenziazione neuronale, il tessuto trapiantato viene preparato per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Proliferazione e differenziamento delle cellule lt-NES

NOTA: le cellule staminali neuroepiteliali (lt-NES) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane a lungo termine sono generate e trasdotte con un vettore lentivirale che trasporta la proteina fluorescente verde (GFP) sotto un promotore costitutivo (cellule GFP-lt-NES). I flaconcini contenenti 3 x 10⁶ cellule devono essere conservati a -150 °C fino all'uso.

1. Preparazione delle soluzioni stock e dei media

1. Diluire 100 μg di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) in 10 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS)-0,1% di albumina sierica bovina (BSA) per avere una concentrazione stock di 10 μg/mL. Preparare aliquote da 100 μl.

2. Diluisci 100 μg di fattore di crescita epidermico (EGF) in 10 mL di PBS-0.1% BSA per avere una concentrazione stock di 10 μg/mL. Preparare aliquote da 100 μl.

3. Aliquot 50x integratore di B27 in un volume di 100 μL per aliquota.

4. Diluisci 10 mg di poli-L-ornitina in 100 mL di acqua deionizzata per avere una concentrazione di 100 μg/mL. Preparare aliquote da 1 ml.

5. Prepara aliquote da 30 μL di 1,20 mg/mL di lamina di topo.

6. Diluire 10 mL di acido tripsina-etilendiammin-tetraacetico (EDTA) (0,25%) in 90 mL di PBS a una concentrazione stock dello 0,025%. Preparare 1 ml di aliquote.

7. Diluisci 0,025 g di inibitore della tripsina in 50 ml di PBS a una concentrazione di 0,5 mg/mL. Preparare 1 ml di aliquote.

8. Diluire 10 μg di Wnt3a (membro della famiglia 3A del sito di integrazione MMTV di tipo senza ali) in 1 mL di PBS-0,1% BSA per avere una concentrazione stock di 10 μg/mL. Preparare la BMP4 (proteina morfogenetica ossea 4) allo stesso modo. Aliquotare in un volume di 100 μl.

9. Diluisci 1 mg di ciclopamina in 2,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) fino a una concentrazione finale di 400 μg/mL e fai aliquote di 100 μL.

10. Prepara il terreno di base (Tabella 1) e il terreno definito dalla differenziazione (DDM, Tabella 2) e conserva a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Rivestimento di piatti di coltura

1. Per pre-rivestire le piastre per la coltura delle cellule GFP-It-NES durante la proliferazione o la differenziazione, diluire la poli-L-ornitina 1:100 in acqua deionizzata e aggiungere 5 mL della soluzione a un matraccio T25. Incubare per una notte a temperatura ambiente (RT).

2. Lava le piastre rivestite di poli-L-ornitina 1x con acqua deionizzata e 1x con PBS.

3. Per le cellule GFP-It-NES in proliferazione, diluire la laminina di topo a 1:500 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C. Per le cellule GFP-It-NES in differenziazione, diluire la laminina di topo a 1:100 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C.

3. Proliferazione delle cellule GFP-lt-NES

1. Scaldare 5 mL (per il lavaggio) e 5 mL (per la semina) di terreno basico in due diverse provette da 15 mL.

2. Scongelare rapidamente una fiala di cellule GFP-lt-NES a 37 °C, trasferirle nella provetta di lavaggio e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.

3. Aspirare il terreno con attenzione senza toccare il pellet e risospendere le cellule in 1 mL di terreno basico preriscaldato. Trasferire la sospensione cellulare nella provetta di semina contenente terreno basico integrato con fattori di proliferazione: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) e B27 (10 ng/mL). Seminare le cellule su un pallone T25 rivestito di poli-L-ornitina/laminina.

4. Nutri le cellule con fattori di proliferazione ogni giorno. Sostituire il supporto se diventa giallo. Passaggio delle celle ogni terzo o quarto giorno (1 giorno dopo che hanno raggiunto il 100% di confluenza).

4. Dividere le cellule GFP-lt-NES per la proliferazione e la differenziazione

1. Preriscaldare 5 mL di terreno basico per pallone (per raccogliere le cellule), più il volume totale necessario per riseminarle.
NOTA: Il passaggio viene effettuato a una diluizione 1:3 per mantenere le cellule in proliferazione, che richiede 15 mL di terreno basico, e una diluizione 1:6 per iniziare la differenziazione, che richiede 30 mL di terreno basico.

2. Rimuovere il terreno dal pallone di coltura cellulare per aspirazione e aggiungere 500 μL di tripsina preriscaldata allo 0,025%. Incubare per 5-10 minuti a RT. Il distacco delle cellule può essere confermato con un microscopio ottico standard con ingrandimento 10x.

3. Aggiungi un volume uguale di inibitore della tripsina (0,5 mg/ mL di concentrazione finale) seguito da 5 mL di terreno basico caldo. Staccare e raccogliere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.

4. Per mantenere le cellule in proliferazione, riplaccare a una diluizione 1:3 in terreno basico fresco integrato con fattori di proliferazione, e ripetere il passaggio 1.3.4.

5. Differenziazione corticale delle cellule GFP-lt-NES

1. Il giorno 0, risospendere le cellule (da utilizzare per la differenziazione) in 30 mL di terreno basico integrato con fattori di proliferazione e piastrle in sei fiasche T25 rivestite di differenziazione (divise 1:6).

2. Il giorno 1, cambia metà del terreno in DDM e aggiungi fattori di proliferazione a metà della loro concentrazione.

3. Il giorno 2, cambia completamente il terreno in DDM integrato con fattori di differenziazione: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) e ciclopamina (400 ng/mL).

4. Il giorno 4, aggiungi solo i fattori di differenziazione. Sostituire il supporto se diventa giallo.

5. Il giorno 6, cambia il mezzo in DDM integrato con BMP4 e Wnt3a. La ciclopamina viene rimossa in questa fase.

6. Il giorno 7, stacca le celle come indicato nei passaggi 1.4.2 e 1.4.3.

2. Trapianto delle cellule GFP-lt-NES in fette organotipiche di hACtx

NOTA: Il tessuto corticale umano adulto (hACtx) deve essere coltivato per 1 settimana prima del trapianto di cellule. Per facilitare la procedura di trapianto, è necessario rimuovere 2 mL di terreno hACtx dalla parte superiore dell'inserto per evitare che il tessuto galleggi.

1. Risospendere le cellule GFP-lt-NES innescate corticalmente (dal passaggio 1.5.6) in una matrice di membrana basale pura e fredda (vedere la Tabella dei materiali) a una concentrazione di 1 x 105 cellule/μL e trasferire la soluzione in una provetta sterile più piccola.

NOTA: Durante la procedura di trapianto, tutti i materiali (puntali per pipette, tubi, capillari, ecc.) devono essere pre-raffreddati per evitare la solidificazione del gel. Scongelare il gel della matrice della membrana basale con ghiaccio per 30 minuti prima dell'uso.

2. Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare in piccole gocce (circa 1 μL ciascuna) infilzando la fetta di tessuto semisecco in vari siti.

3. Incubare a 37 °C per 30 minuti affinché il gel si solidifichi. Trasferire la piastra dall'incubatore alla cappa e aggiungere con cautela 2 mL di terreno hACtx alla parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto.

4. Sostituire il terreno di coltura con terreno hACtx fresco una volta alla settimana.

Risultati

Tabella 1: Composizione del terreno di proliferazione delle cellule lt-NES (terreno basico).

Basic Medium Concentrazione	di stock	Concentrazione finale	Per 100 mL
DMEM/F12 con L-Glutammina	1x

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MANUTENZIONE E COLTURA DEL TESSUTO NEOCORTICALE UMANO Piastra
a 6 pozzetti	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold inserto a 6 pozzetti	Reinnervate Ltd	AVP004-96
Integratore B27 (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys senza fenolo rosso	Tecnologie delle cellule staminali	#05791	Indicato come mezzo neuronale nel testo
Unità filtranti 250 mL o 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Pinze	Qualsiasi Gentamicina adatta
(50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Indicato come L-glutammina nel testo
Tettarella di gomma + Pipetta di vetro	Qualsiasi
GENERAZIONE DI cellule lt-NES
2-Mercaptoetanolo 50 mM	ThermoFisher Scientific
EGF ricombinante senza animali	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Frazione di albumina bovina V (soluzione al 7,5%)	ThermoFisher Scientific	15260037
Ciclopamina, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Soluzione di glucosio (45%)	Sigma	G8769
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Soluzione salina tampone fosfato di Dulbco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Senza calcio e magnesio
Proteine di Topo Laminina,	Thermo Fisher Scientific 23017015
MEM Soluzioni di aminoacidi non essenziali (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Integratore (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poli-L-Ornitina	Merk	P3655
Sistemi di ricerca e sviluppo per proteine BMP-4 umane ricombinanti		314-BP-010
Sistemi di ricerca e sviluppo	per proteine Wnt-3a umane ricombinanti	5036-WN
piruvato di sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Inibitore della tripsina di soia, polvere	Thermo Fisher Scientific	17075029
Acqua	deionizzata sterileMilliQ		Sistema di filtraggio MilliQ
Tripsina EDTA (0,25%)	Sigma	T4049-500ML
ATTREZZATURA PER COLTURE CELLULARI
Pipette a volume regolabile 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	Various
Matrice a membrana basale qualificata ESC (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuga	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubatore	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Utensile da taglio per cellule staminali 0,190-0,210 mm	Vitrolife	14601
Provette sterili	Sarstedt	Varie
pipette sterili monouso in vetro Pasteur 150 mm	VWR	612-1701
Puntali per pipette sterili 0,1-1000 μL	Biotix VWR	Varie
pipette sierologiche sterili 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Varie
fiasche T25 Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

adatto 31350010 Natural