Iniezione stereotassica di virus per la modificazione genetica stabile in un modello murino

Abstract

Fonte: Porlan, E., et al. Modificazione genetica stabile ed efficiente delle cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra la modificazione genetica stabile delle cellule staminali neurali (NSC) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) attraverso l'iniezione stereotassica di un gene terapeutico portatore di virus in un modello murino. Il virus entra nelle NSC, subisce la trascrizione inversa, si integra nel genoma e consente una modificazione genetica stabile ed efficiente per applicazioni neuroterapeutiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione stereotassica di ventricolo laterale (LV) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ)/bordo striato o nella

1. microiniezione LV di LV
   1. Seleziona e sterilizza gli strumenti necessari per l'intervento chirurgico (bisturi, trapano e piccole pinzette).
   2. Anestetizzare un topo di 6-8 settimane iniettando per via intraperitoneale (ip) una miscela di ketamina e medetomidina sotto supervisione veterinaria. Pesare ogni animale e dosare ciascuno con 50-75 mg di ketamina e 0,5-1 mg di medetomidina per kg di peso corporeo del topo (circa 100-125 μl della soluzione di lavoro ketamina/medetomidina per topo).
   3. Valuta il piano anestetico pizzicando le dita dei piedi, la coda o l'orecchio e assicurandoti che l'animale non mostri alcuna reazione.
   4. Una volta che il topo è stato anestetizzato, iniettare butorfanolo per via sottocutanea a una dose finale di 0,4-0,5 mg per kg di peso del topo per ridurre al minimo il dolore post-chirurgico.
   5. Radere l'area tra le orecchie e disinfettare la pelle utilizzando uno iodoforo come lo iodopovidone o l'etanolo al 70%. Detergere con applicatori sterili con punta in cotone. Fare attenzione a non bagnare eccessivamente l'animale, in quanto ciò può esacerbare l'ipotermia.
   6. Posizionare l'animale in posizione prona su un telaio stereotassico e fissare con cura la testa utilizzando le barre auricolari e il supporto per il palato dell'apparecchio. Tenere il mouse con un termoforo impostato a 37 °C e applicare lubrificante oftalmico sugli occhi.
   7. Praticare un'incisione lunga 1 cm sulla pelle della testa longitudinalmente utilizzando un bisturi e ritrarre delicatamente la pelle per esporre il cranio utilizzando una pinzetta sottile.
   8. Pulire accuratamente la superficie ossea con un applicatore sterile con punta di cotone. Pulire l'osso del cranio esposto da qualsiasi tessuto residuo.
   9. Montare la siringa sterilizzata sul dispositivo stereotassico utilizzando il supporto della siringa.
   10. Spostare il supporto della siringa lungo gli assi x, y e z fino a quando la punta dell'ago della siringa non si posiziona sulla bregma, il punto di congiunzione in cui la sutura sagittale (longitudinale e mediale) è intersecata perpendicolarmente dalla sutura coronale (Figura 1b). Assicurarsi che la posizione "zero" dell'asse dorso-ventrale (DV) sia sulla superficie del cranio in corrispondenza della bregma.
   11. Spostare la siringa sulle coordinate di destinazione x e y (vedere Tabella 1 e Figura 1b).
   12. Annotare le coordinate di destinazione x, y e z sulla scala Vernier per poter tornare al sito di iniezione in un secondo momento. Segna l'osso alle coordinate x e y usando un pennarello chirurgico.
   13. Allontanare la siringa dall'area di lavoro.
   14. Usando un trapano elettrico, fai un foro nel cranio con attenzione per non danneggiare il cervello. Non forare la superficie del piale, poiché ciò potrebbe danneggiare la superficie del cervello.
   15. Caricare la siringa con 1 μl della soluzione virale da 10⁶ TU/μl (unità di trasduzione per microlitro). Utilizzare un ago affilato smussato calibro 33 la cui punta ha un angolo di 10-12°. Posizionare l'ago della siringa con un angolo di 90° rispetto alla superficie del cervello.
   16. Riportare la siringa nel sito di iniezione e spostarla verso il basso fino a quando la punta tocca la superficie del piale.
   17. Penetrare nel cervello con la siringa fino alla coordinata z nell'asse DV.
   18. Rilasciare lentamente la sospensione virale a una velocità di 0,2 μl/min per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale dovuti all'eccessiva pressione del fluido.
   19. Attendere 5-10 minuti per ridurre al minimo il riflusso della sospensione virale, quindi ritrarre la siringa molto lentamente.

Regione di iniezione	Coordinate
	antero-posteriore (AP)	Medio-laterale (ML)	Dorso-ventrale (DV)
ZES/bordo striato	+0,6 mm	+1,2	mm-3,0 mm
Ventricolo	laterale-0,3 mm	+1,0	mm-2,6 mm

Tabella 1: Coordinate stereotassiche per le iniezioni. Per gli assi antero-posteriore (AP) e medio-laterale (ML), le coordinate x e y sono date come distanza (in mm) dal bregma. "-" indica "verso la parte posteriore". Per le coordinate DV, "zero" è la superficie del cranio nel punto di bregma e le coordinate DV indicano la distanza (in mm) da questo punto.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica delle diverse parti della procedura. a) Generazione di LV per studi di marcatura in vivo, dalla trasfezione di cellule 293T (HEK293T) del rene embrionale umano con plasmidi appropriati per generare i LV, alla deter...

Materiali