Manipolazione delle cellule della placca neurale attraverso la nanoiniezione in utero in un modello murino embrionale

Abstract

Fonte: Mangold, K., H el. al., Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il metodo di nano-iniezione in utero per il targeting della piastra neurale in un modello murino embrionale. Una soluzione lentivirale ad alto titolo viene iniettata nella cavità amniotica, dove si integra nelle cellule della placca neurale, consentendo una manipolazione genica stabile per la ricerca sullo sviluppo neurologico e le applicazioni terapeutiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezioni

NOTA: Tutti gli strumenti utilizzati in questa procedura vengono sterilizzati prima dell'intervento chirurgico e tra un topo e l'altro.

1. Anestetizzare la prima femmina con carie di dimensioni ideali.
2. Posiziona e fissa la femmina sul tavolo.
3. Applicare il gel per gli occhi sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e iniettare antidolorifici per via sottocutanea.
   NOTA: Analgesici raccomandati: Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg di peso corporeo) o flunixina (2,5 mg/kg) o simili in conformità con le normative locali sul benessere degli animali. L'analgesia perioperatoria multimodale viene mantenuta con analgesici iniettati e isoflurano.
4. Preparare asetticamente il basso addome strofinando con un panno imbevuto di soluzione di clorexidina 0,5 mg/mL (o simile) e asciugare la pelle. Utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione cutanea verticale della linea mediana di 1,5-2,0 cm nell'addome inferiore.
   NOTA: Preparare l'area chirurgica seguendo le routine di disinfezione approvate localmente.
5. Sollevare delicatamente la pelle e liberare la pelle dallo strato muscolare sottostante, a circa 1 cm attorno al punto di incisione, per facilitare la sutura dopo l'intervento chirurgico.
6. Praticare un'incisione verticale della linea mediana di 1 cm nello strato muscolare.
7. Con un paio di pinze, solleva un lato della pelle e dello strato muscolare e con l'altro paio, cerca le corna uterine.
   NOTA: Le decidue sono disposte come perline su una collana, mentre l'intestino è un lungo tubo continuo (Figura 1A).
8. Con il forcipe, estrarre con cautela entrambe le corna uterine dall'addome. Tenere il tessuto tra gli embrioni; non schiacciarli direttamente (Figura 1B).
   NOTA: L'utero è attaccato al corpo in corrispondenza della cervice e le due ovaie/ovidotti sono attaccate tramite legamenti. Non tirare/staccare l'utero da questi punti di ancoraggio.
9. Conta e prendi nota del numero di embrioni sui lati sinistro e destro.
10. Numerare gli embrioni dall'ovaio alla cervice o dalla cervice all'ovaio.
    NOTA: Questo è particolarmente importante se gli embrioni iniettati verranno raccolti nelle fasi embrionali.
11. Con un batuffolo di cotone umido, spingere delicatamente tutti gli embrioni nella cavità addominale tranne i primi tre da iniettare.
12. Posizionare una goccia di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) sull'elastico della capsula di Petri e tenerla immediatamente sopra gli embrioni.
13. Inserire una pinza chiusa nell'incisione dell'elastico e rilasciare la pinza per aprire l'incisione elastica in modo che il liquido cada sugli embrioni.
    NOTA: Ciò garantisce la reidratazione degli embrioni e che la membrana elastica aderisca alla pelle bagnata della femmina, prevenendo la fuoriuscita di PBS nei passaggi successivi.
14. Tirare una sezione dell'utero, corrispondente a tre embrioni, attraverso l'elastico con una pinza e posare delicatamente la capsula di Petri sull'addome della femmina.
15. Con la pinza e un batuffolo di cotone umido, regolare la posizione dell'utero e l'elastico per assicurarsi che l'elastico sia sigillato alla pelle della femmina per evitare perdite di PBS.
16. Usa i quattro piedini di argilla per fissare e fissare la capsula di Petri immediatamente sopra l'addome, riducendo la pressione sulla femmina e la sensibilità dell'imaging alla respirazione e al battito cardiaco della femmina.
17. Premere il cilindro di argilla modellabile verso il basso a destra degli embrioni/utero per fissare l'utero (Figura 1C).
    NOTA: Queste istruzioni di orientamento presuppongono che l'ago si trovi a sinistra della femmina e che gli embrioni del corno uterino sinistro della femmina siano esposti. Il lato dell'utero (corno uterino sinistro o destro) è cruciale in quanto l'amniotico (AC) è rivolto verso l'ago (corno sinistro; Figura 1D) o è rivolto verso il cilindro di argilla stabilizzatore (corno destro; Figura 1E).
18. Per iniettare gli embrioni dal corno uterino destro, posizionare il cilindro di argilla sul lato sinistro degli embrioni (Figura 1F) e ruotare il tavolo riscaldante di 180° (Figura 1G) per ottenere l'orientamento corretto. Se invece l'ago può essere spostato, adattarlo in modo appropriato alla configurazione pertinente.
19. Aggiungere PBS alla capsula di Petri fino a quando gli embrioni e l'utero non sono coperti di PBS.
20. Abbassare la sonda ecografica nel PBS e regolare il mouse/tavolo chirurgico in modo che il primo embrione sia allineato con la sonda ecografica per facilitare la registrazione delle iniezioni.
    NOTA: "Primo" si riferisce alla numerazione degli embrioni dall'ovaio alla cervice.
21. Scansiona tutti e tre gli embrioni e ispeziona gli AC. Determina il volume di iniezione come segue:
    1. Misura il diametro dell'AC con la macchina ad ultrasuoni. Iniettare 69 nL se il diametro AC è ≤0,2 mm; iniettare 2 x 69 nL (= 138 nL) se il diametro AC è >0,2 mm e ≤0,29 mm; e iniettare 3 x 69 nL (= 207 nL) se il diametro AC > 0,29 mm (Figura 1H).
       >NOTA: Esperimenti precedenti hanno dimostrato che volumi di iniezione fino a 207 nL sono ben tollerati a E7,5. Le iniezioni di successo con un impatto minimo sulla sopravvivenza si ottengono quando l'aumento del volume relativo dell'AC non supera il 90%. La variazione delle dimensioni dell'AC tra i compagni di cucciolata o i ceppi di topo è comune e può richiedere un'ulteriore ottimizzazione.
22. Impostare i volumi di iniezione con il controller di iniezione.
23. Impostare la velocità di iniezione su un rallentamento con una velocità di iniezione di 23 nL/s.
    NOTA: Diversi modelli di apparecchiature possono comportare forze di iniezione diverse.
24. Abbassare l'ago nel PBS utilizzando le ruote principali sul sistema di binari (piani x e z, Figura 1I) e premere Svuota sul controller del nanoiniettore fino a quando il liquido non raggiunge la punta dell'ago.
    NOTA: Se l'ago si è ostruito, premere Svuota può sciogliere l'intasamento e/o espellere l'intasamento.
25. Sollevare l'ago dal PBS e premere Inietta. Verificare che venga scaricata una goccia del volume approssimativo desiderato.
26. Abbassare l'ago nel PBS e allinearlo con la sonda ecografica e l'embrione spostando il nanoiniettore con la ruota del piano y sul micromanipolatore (Figura 1J).
    NOTA: La punta dell'ago è perfettamente allineata quando appare come un punto luminoso sull'immagine ecografica (Figura 1K, L). L'ago può essere spostato in tutti e tre i piani di direzione con il micromanipolatore.
27. Regolare l'angolo dell'ago con la rotella dell'angolo di iniezione per garantire un angolo di iniezione quasi perpendicolare rispetto alla parete uterina. Inserire l'ago nell'AC con un solo movimento utilizzando la rotella di iniezione sul micromanipolatore (Figura 1J-M). Tieni d'occhio la luminosità della punta dell'ago. Se la punta dell'ago scompare dall'immagine ecografica, spostare la sonda ecografica in avanti o indietro per riportare l'ago a fuoco.
    NOTA: Una volta che l'ago è all'interno dell'AC, è possibile apportare piccole modifiche alla posizione dell'ago e alla messa a fuoco senza danneggiare l'embrione (regolazioni entro ~0,3 mm). Non regolare la posizione dell'ago più di così.
28. Premere Inietta (per 207 nL, impostare il volume a 69 nL e iniettare tre volte). Dopo l'iniezione, attendere altri 5-10 secondi prima di ritrarre l'ago con un movimento delicato.
29. Sposta la fase all'embrione successivo e ripeti i passaggi 1.22-1.26 per gli altri due embrioni se hanno dimensioni AC adeguate.
30. Sollevare la sonda ecografica e l'ago dal PBS utilizzando il micromanipolatore. Allontanare l'ago dall'operatore per evitare danni e lesioni.
31. Con il forcipe, dirigere il 1° e il 2° embrione nell'addome della femmina spingendoli delicatamente attraverso l'elastico. Afferrare delicatamente il tessuto adiacente al 3° embrione e tirare l'utero verso l'estremità superiore dell'incisione elastica. Sollevare delicatamente il 4°-6° embrione con una pinza e lasciare che il 3° embrione rientri nell'addome.
    NOTA: Questo passaggio può essere eseguito senza cambiare il PBS o rimuovere la capsula di Petri.
32. Ripetere se necessario fino a quando tutti gli embrioni con AC ottimali sono stati iniettati o il limite di tempo è stato raggiunto.
33. Spingi delicatamente gli embrioni/utero nell'addome della femmina.
34. Aspirare il PBS e rimuovere la capsula di Petri. Se è stato utilizzato un virus, trattarlo come rifiuto infettivo.
35. Cucire insieme lo strato muscolare con Vicryl (USP 6-0, lunghezza dell'ago 13 mm, 3/8 di cerchio) in semplici suture continue o interrotte e chiudere la pelle con 1-2 clip (vedere la Tabella dei Materiali).
36. Spegnere la pompa dell'isoflurano.
37. Rimuovere il nastro chirurgico e posizionare la femmina in posizione prona (a pancia in giù) in una gabbia pulita su una piastra riscaldante a 40 °C.
    NOTA: La femmina dovrebbe riprendere conoscenza e muoversi entro 10 minuti. Assicurarsi che la procedura sia completata entro 30 minuti. Il background genetico, l'età e il peso della femmina possono influenzare la sensibilità all'anestesia. Monitorare i topi durante l'intervento chirurgico per segni di respirazione lenta (respirazione lenta significa che l'anestesia è troppo profonda) o movimento (l'anestesia è troppo leggera). Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg di peso corporeo) o flunixina (2,5 mg/kg) o simili, in conformità con le normative locali sul benessere degli animali, possono essere somministrate 8 ore dopo la prima iniezione, se necessario.
38. Se deve essere iniettata un'altra femmina, preparare l'area chirurgica monitorando il risveglio della prima.
    1. Pulisci gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per rimuovere eventuali residui di sangue o tessuto e sterilizzali nello sterilizzatore a perle di vetro preriscaldato per 10 secondi. Elimina i tamponi di cotone e usa carta velina. Asciugare la capsula di Petri e i pezzi di argilla con carta velina.
39. Ripetere i passaggi 1.1-1.35 fino a quando tutte le femmine sono state iniettate.
40. Svuotare e gettare l'ago.
    1. Se c'è un virus o una soluzione iniettabile rimasta nell'ago, premi Svuota sul nanoiniettore e svuota il contenuto dell'ago su carta velina.
    2. Ritrarre completamente lo stantuffo metallico premendo Fill fino a quando non viene emesso un doppio segnale acustico dal controller, che indica che lo stantuffo è completamente retratto.
    3. Allentare la pinza e far scorrere l'ago fuori dallo stantuffo di metallo. Gettare l'ago nel contenitore dei rifiuti di oggetti taglienti.
41. Pulire il banco BSL-2 (Biosicurezza Livello 2).
    1. Se è stato utilizzato un virus, spruzza l'intero campo chirurgico con disinfettante (vedi la Tabella dei Materiali). Dopo 15 minuti, rimuovere il disinfettante e pulire l'intero campo chirurgico con etanolo al 70%. Se non è stato utilizzato alcun virus, pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.
    2. Rimuovere eventuali residui di PBS dalla sonda ecografica con carta velina asciutta, morbida e priva di lanugine.
42. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida sulla biosicurezza.
43. Spegnere l'ecografo, il tavolo riscaldante, il banco BSL2 e l'alimentazione O₂.

Risultati

Figura 1: Dimensioni e orientamento ottimali della cavità amniotica per iniezioni di successo. (A) Corno uterino con più decidue E7,5, a forma di stringa di sfere (in basso) rispetto all'intestino crasso (in alto). (

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL Siringa	BD Bioscience	309628
27 G Ago	BD Bioscience	300635
capillari da 3,5 pollici	Drummond Scientific	3000203G/X	Sono stati utilizzati per estrarre gli aghi domestici
Trasduttore della serie MS da 70 MHz	Visual Sonics	MS700
Aquasonic gel per ultrasuoni trasparente	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 topi	Charles River, Germania	Crl:CD1(ICR)	Femmine: a partire dalle 8 settimane di etàMaschi: a partire dalle 12 settimane
di età Cotton Swab	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Pinze per medicazione delicate dritte 13 cm	Agnthos	08-032-130
Clip EZ 9 mm	Angthos	59027	Clip
Forbici per iride, Super Cut, dritte, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorane	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Acquistato dalla farmacia svedese
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Nastro a membrana	Visual Sonics	SA-11053
Estrattore per micropipette	Strumento Sutter	P-97
Modellazione Clay	Sense AB	10209
Tavolo per la manipolazione del mouse	Visual Sonics	50249
Kit iniettore automatico Nanoject II	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Piastra di Petri con apertura centrale (parete bassa)	Visual Sonics	SA-11620
Piastra di Petri, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	disinfettante 130000132037
Membrana siliconica	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, sterilizzatore a perline calde	Angthos	31100
Nastro chirurgico (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Sistema di anestesia	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Stazione di imaging 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; Ago C-3, filamento viola da 45 cm	Agnthos	J384H