Trasferimento genico nelle cellule di Schwann del nervo sciatico del roditore tramite elettroporazione

Abstract

Fonte: Ino, D. et. al., Trasferimento genico in vivo alle cellule di Schwann nel nervo sciatico del roditore mediante elettroporazione. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra il trasferimento genico in vivo alle cellule di Schwann del nervo sciatico del roditore mediante elettroporazione. Una soluzione plasmidico di DNA-colorante viene iniettata nel nervo e gli impulsi elettrici facilitano l'ingresso del DNA. Il DNA si integra successivamente nel genoma della cellula, consentendo il trasferimento genico di successo nelle cellule di Schwann.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del DNA plasmidico

1. Generare plasmidi di DNA per l'elettroporazione in vivo subclonando la sequenza di DNA complementare (cDNA) o di RNA a forcina corta (shRNA) in un plasmide di espressione per cellule di mammifero. Utilizzare un potenziatore precoce immediato del citomegalovirus e un plasmide guidato dal promotore di β-actina (CAG) di pollo perché consente un'espressione forte e stabile. Per l'espressione di shRNA sotto il controllo di un promotore CAG, utilizzare un sistema a cassetta di shRNA basato su mir30 per il subclonaggio dello shRNA.
2. Purificare il DNA plasmidico con un maxi-kit di preparazione secondo le istruzioni del produttore e risospendere il DNA con soluzione salina tamponata HEPES (140 mM di cloruro di sodio, NaCl, 0,75 mM di fosfato acido monosodico, Na₂HPO₄, 25 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico (HEPES); pH 7,40). Regolare la concentrazione di DNA a ≥4 μg/μl.
3. Preparare la soluzione di DNA plasmidico a una concentrazione di 4 μg/μl e aggiungere una quantità minima di colorante verde veloce (concentrazione finale dello 0,01%) per etichettare il sito di iniezione. Quando è richiesta l'elettroporazione simultanea di più plasmidi, regolare la concentrazione totale della soluzione di DNA plasmidico a 4 μg/μl.
   NOTA: La composizione ottimale del DNA plasmidico deve essere determinata in base all'efficienza di trasfezione di ciascun plasmide.

2. Sterilizzazione degli strumenti chirurgici e degli

1. strumenti chirurgici in autoclave salina e della soluzione di NaCl allo 0,9%.

3. Preparazione della micropipetta di vetro

1. Estrarre le pipette di vetro utilizzando un estrattore per pipette. Tagliare la punta della pipetta a un diametro di 30-50 μm. Utilizzare i seguenti parametri: Calore, 600; Velocità, 50; Tempo, 75.

4. Chirurgia animale, iniezione di DNA ed elettroporazione

NOTA: Una panoramica di questa fase è descritta nella Figura 1. Sebbene la procedura per i cuccioli di ratto sia descritta qui, il metodo è applicabile anche agli animali più maturi che utilizzano la stessa procedura.

1. Anestetizzare il ratto con isoflurano nella scatola di induzione fino a quando l'animale non si immobilizza regolando il flusso di ossigeno a 0,4 L/min e la concentrazione di isoflurano al 4% (vol/vol). Eseguire il pizzicamento delle dita dei piedi per confermare la corretta anestesia.
2. Metti il ratto sullo scaldino preriscaldato sotto un microscopio binoculare e mantieni l'anestesia somministrando continuamente isoflurano attraverso la maschera facciale. Regolare il flusso di ossigeno a 0,2 L/min e la concentrazione di isoflurano al 2% (vol/vol). Usa un collirio per prevenire la secchezza degli occhi se gli occhi dell'animale sono aperti.
3. Fissare le gambe con nastro chirurgico.
4. Pulire la pelle della parte posteriore della coscia con iodio povidone e praticare un'incisione con un bisturi
   NOTA: Radere le aree chirurgiche se sono coperte di peli.
5. Esporre il nervo sciatico creando un'apertura tra il muscolo quadricipite femorale e il muscolo bicipite femorale con aghi da cucito.
6. Inumidire il nervo con una soluzione di NaCl allo 0,9%. Assorbire l'acqua in eccesso con carta priva di lanugine.
7. Inserire la base di una micropipetta di vetro su un tubo flessibile e riempire la quantità adeguata di soluzione di DNA (almeno un microlitro) nella micropipetta aspirando delicatamente.
8. Sollevare il nervo esposto tirando delicatamente il lato distale del nervo utilizzando un ago.
   NOTA: Non applicare tensione al nervo per ridurre al minimo lo stress meccanico.
9. Inserire la micropipetta di vetro nel sito distale del nervo e iniettare la soluzione di DNA applicando pressione (cioè soffiando nell'estremità aperta del tubo flessibile). Iniettare la soluzione di DNA fino a quando il nervo appare verde (massimo 1 μl). Poiché l'inserimento frequente della micropipetta può danneggiare il nervo, non inserire la micropipetta più di due volte.
10. Posizionare un elettrodo di platino a pinzetta a circa 1-2 mm di distanza dal nervo. Riempire lo spazio tra l'elettrodo e il nervo con una soluzione di NaCl allo 0,9%.
    NOTA: Non tenere il nervo con l'elettrodo per evitare stress meccanici sul nervo.
11. Applicare impulsi elettrici al sito di iniezione utilizzando un elettroporatore con l'elettrodo. Dopo il primo set di impulsi, invertire l'elettrodo e applicare un altro set di impulsi. Utilizzare i seguenti parametri: tensione, 50 V; durata dell'impulso, 5 msec; intervallo di pulsazione, 100 msec; numero di impulsi, 4 volte.
12. Pulire il sito di elettroporazione con una soluzione di NaCl allo 0,9%.

5. Post-elettroporazione

1. Chiudere le incisioni con colla cianoacrilica.
2. Dopo aver asciugato la colla, pulire la ferita con iodio povidone.
3. Libera il cucciolo dalla maschera facciale. Scaldare il cucciolo su uno scaldino per almeno un'ora in modo da consentirgli di riprendersi completamente dall'anestesia.

Risultati

Figura 1: Schema del metodo di elettroporazione in vivo. In primo luogo, viene esposto il nervo sciatico del ratto anestetizzato. In secondo luogo, il DNA plasmidico viene iniettato nel nervo sciatico. In terzo luogo, gli impulsi elettrici vengono erog...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Maxi plasmide genopuro	Roche	03 143 422 001	Kit di purificazione del DNA plasmidico
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Colorante per iniezione di DNA
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Vetro capillare
Tubo di aspirazione	Drummond	05-2000-00	Tubo di aspirazione per micro iniezione
MODELLO P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		per micropipette
CUY21	BEX	CUY21	Generatore di impulsi
Riscaldatore elettrico	KODEN	CAH-6A	Riscaldatore durante l'intervento chirurgico
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anestetico

Estrattore Elettroporatore a cellula singola a cellula singola