Somministrazione sostenuta del fattore di crescita nervoso utilizzando un film di silicio poroso in cellule di feocromocitoma di ratto 12

Abstract

Fonte: Rosenberg, M., et al. Progettazione di film di silicone poroso come trasportatori del fattore di crescita nervoso. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra l'uso di un film di silicio poroso nanostrutturato (PSi) degradabile per il rilascio prolungato del fattore di crescita nervoso (NGF) per supportare la differenziazione cellulare PC12. L'NGF viene adsorbito sui pori del film attraverso interazioni elettrostatiche e viene gradualmente rilasciato nel mezzo per diffusione e degradazione dello scaffold. Questa somministrazione controllata promuove la sopravvivenza delle cellule PC12 e facilita la crescita e la ramificazione dei neuriti per un periodo prolungato.

Protocollo

1. Fabbricazione di supporti in silicio poroso ossidato (PSiO₂)

1. Taglio di un wafer di silicio (Si) (lucidato su un lato sulla faccia <100> e fortemente drogato con boro, tipo p, 0,95 mΩ·cm) in campioni da 1,5 cm × 1,5 cm utilizzando una penna con punta di diamante.
2. Ossidare i campioni di Si in un forno tubolare a 400 °C per 2 ore in aria ambiente (velocità di riscaldamento: 25 °C/min, raffreddamento naturale).
3. Immergere i campioni di Si in una soluzione acquosa di acido fluoridrico (HF) (48%), acqua bidistillata (ddH₂O) ed etanolo (99,9%) (1:1:3 v/v/v) per 5 minuti; quindi sciacquare i campioni con etanolo tre volte e asciugarli sotto un flusso di azoto.
   NOTA: Preparare e conservare la soluzione HF solo in plastica, poiché l'HF dissolve il vetro.
   ATTENZIONE: L'HF è un liquido altamente corrosivo e deve essere maneggiato con estrema cura. In caso di esposizione, sciacquare abbondantemente con acqua e trattare la zona interessata con gel antidoto HF; Consultare immediatamente un medico.
4. Montare il campione di Si in una cella di incisione in politetrafluoroetilene, utilizzando una striscia di foglio di alluminio come contatto posteriore e una bobina di platino come controelettrodo.
5. Mordenzare uno strato sacrificale in una soluzione 3:1 (v/v) di HF acquoso ed etanolo (99,9%) per 30 s a una densità di corrente costante di 250 mA/cm²; quindi sciacquare la superficie del film PSi risultante con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
6. Sciogliere lo strato poroso appena mordenzato in una soluzione acquosa di idrossido di sodio (NaOH) (0,1 M) per 2 minuti. Quindi, sciacquare con etanolo tre volte e asciugare sotto un getto di azoto.
7. Immergere il campione in una soluzione acquosa di HF (48%), ddH₂O ed etanolo (99,9%) (1:1:3 v/v) per 2 minuti. Quindi, sciacquare con etanolo tre volte e asciugare sotto un getto di azoto.
8. Incidere elettrochimicamente il campione di Si in una soluzione 3:1 (v/v) di HF acquoso ed etanolo (99,9%) per 20 s a una densità di corrente costante di 250 mA/cm²; quindi sciacquare la superficie del film PSi risultante con etanolo tre volte e asciugare sotto un flusso di azoto.
9. Ossidare termicamente i campioni di PSi appena incisi in un forno tubolare a 800 °C per 1 ora in aria ambiente (velocità di riscaldamento: 25 °C/min, raffreddamento naturale) per formare un'impalcatura porosa di SiO₂ (PSiO₂).
10. Centrifugare i campioni PSiO₂ con un fotoresist denso positivo a 4.000 giri/min per 1 minuto; quindi cuocere i campioni rivestiti a 90 °C per 2 minuti (velocità di riscaldamento: 5 °C/min, raffreddamento naturale).
11. Tagliare i campioni PSiO₂ in campioni da 8 mm × 8 mm utilizzando una sega per cubetti.
12. Per rimuovere il fotoresist, immergere i campioni tagliati a cubetti in acetone per 3 ore, quindi sciacquare accuratamente con etanolo e asciugare sotto un getto di azoto.

2. Caricamento di PSiO₂ con fattore di crescita nervoso (NGF)

1. Per preparare la soluzione di caricamento NGF, sciogliere 20 μg di β-NGF murino in 400 μL di soluzione 1:1 (v/v) di soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) e ddH₂O.
2. Aggiungere 52 μl della soluzione di caricamento sopra il campione PSiO₂ e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT) in un piatto tappato.
   NOTA: Mantenere un'elevata umidità nel piatto per evitare che la soluzione si secchi durante l'incubazione.
3. Raccogliere la soluzione sopra il campione per la successiva quantificazione del contenuto di NGF all'interno del vettore PSiO₂.
   NOTA: Il caricamento dell'NGF in PSiO₂ deve essere eseguito immediatamente prima dell'uso previsto; il protocollo non può essere messo in pausa qui a causa del rischio di essiccazione e denaturazione della proteina.

3. Vitalità e crescita cellulare in presenza di portatori PSiO₂ caricati con NGF Coltura

1. cellulare di feocromocitoma di ratto (PC12)
   1. Preparare il terreno di crescita di base aggiungendo il 10% di siero di cavallo (HS), il 5% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e lo 0,2% di amfotericina al terreno del Roselle Park Medical Institute (RPMI).
   2. Preparare un mezzo di differenziazione aggiungendo l'1% di HS, l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina-streptomicina e lo 0,2% di amfotericina al mezzo RPMI.
   3. Coltivare la sospensione cellulare (10-6 cellule) in un pallone di coltura da 75 cm² con 10 mL di terreno di crescita basico per 8 giorni; ogni 2 giorni, aggiungere 10 mL di terreno di crescita basico al pallone.
   4. Per generare una coltura cellulare PC12 differenziata, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga; centrifugare le cellule per 8 minuti a 200 x g e RT. Scartare il surnatante.
   5. Sospendere le cellule in 5 mL di terreno di crescita basico fresco e centrifugare nuovamente le cellule per 5 minuti a 200 x g e RT; scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di crescita basico.
   6. Per separare i gruppi di cellule, aspirare le cellule dieci volte utilizzando una siringa da 23 G.
   7. Contare le cellule utilizzando un contacellule emocitometrico e seminare 10⁴ cellule/cm² area di lavoro su piastre rivestite di collagene di tipo I in presenza di terreno di differenziazione.
   8. Dopo 24 ore, aggiungere β-NGF murino fresco (50 ng/mL) o un vettore PSiO₂ caricato con NGF per piastra.
      >NOTA: Concentrazioni più elevate di NGF (>50 ng/mL) hanno l'effetto esatto della concentrazione specificata.
   9. Rinnovare il mezzo di differenziazione ogni 2 giorni.
   10. Per valutare la vitalità cellulare, aggiungere il 10% (v/v) della soluzione dell'indicatore di vitalità (a base di resazurina) in punti temporali rappresentativi e incubare per 5 ore a 37 °C; misurare l'assorbanza a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Gadot	830101375
Amfotericina	Biological Industries	03-028-1B
HF acquoso (48%)	Merck	101513
AZ4533 fotoresist	Metal Chem, Inc.	AZ4533
Frazione BSA v	MP biomedicals	216006950
Soluzione BSA (10%)	Biological Industries	03-010-1B
Collagene di tipo l	Corning Inc.
Collagenasi	Enco	LS004176
Vetrini coprioggetti in plastica rivestiti di collagene	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
Etanolo assoluto (99,9%)	Merck	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidina-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Miscela di nutrienti F-12 di prosciutto	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 medio	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-glutammina	Biological Industries	03-020-1A
Murine β-NGF	Peprotech	450-34-20
Asino normale siero (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papaina	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7,4)			Preparato sciogliendo 10 mM di Na₂HPO₄, 1,8 mM di KH₂PO₄, 137 mM di NaCl e 2,7 mM di KCl in acqua bidistillata (ddH₂O, 18 MΩ·cm).
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
Linea cellulare PC12	ATCC	CRL-1721
Penicillina-streptomicina	Biological Industries	03-032-1B
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
Reagente PrestoBlue	Thermo Scientific	A13261
RPMI medio	Industrie Biologiche	01-100-1A
Si wafer	Siltronix Corp.		Altamente drogato con B, tipo p, resistività 0,00095 Ω cm, orientato <100>
Azazuro di sodio	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
Acido tannico	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	Anno 1279

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