Espressione genica tramite elettroporazione di una singola cellula in colture di fette di ippocampo di topo

Abstract

Fonte: Keener, D. G., et al. Elettroporazione a singola cellula in diverse colture organotipiche di neuroni eccitatori eccitatori e inibitori specifici di classe dell'ippocampo di topo. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra il processo di elettroporazione a singola cellula per introdurre il DNA plasmidico nei neuroni all'interno di colture di fette di ippocampo di topo. La procedura prevede il posizionamento preciso della pipetta, la regolazione della pressione e gli impulsi di elettroporazione per permeabilizzare transitoriamente la membrana neuronale, facilitando il trasferimento genico. Dopo l'elettroporazione, la fetta viene incubata per consentire l'espressione del gene di interesse introdotto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione della coltura della fetta

1. Preparare le colture organotipiche della fetta ippocampale del topo come descritto in precedenza, utilizzando topi postnatali di 6-7 giorni di entrambi i sessi.
   1. Preparare i terreni di dissezione per la coltura organotipica di fette costituite da (in mM): 238 saccarosio, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ e 11 glucosio in acqua deionizzata, quindi gas con 5% CO₂/95% O₂ a un pH di 7,4.
   2. Preparare terreni di coltura organotipici a fette costituiti da: 78,8% (v/v) di acido medio essenziale minimo, 20% (v/v) di siero di cavallo, 17,9 mM di NaHCO₃, 26,6 mM di glucosio, 2 M di CaCl₂, 2 M di MgSO₄, 30 mM di acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico (HEPES), insulina (1 μg/mL) e 0,06 mM di acido ascorbico, pH regolato a 7,3. Regolare l'osmolarità a 310-330 osmolo utilizzando un osmometro.
   3. Sezionare l'ippocampo dall'intero cervello usando due spatole e affettare (400 μm) usando un tritatessuti. Separare le fette utilizzando due pinze e trasferirle su inserti di coltura cellulare da 30 mm in una piastra a 6 pozzetti riempita con terreni di coltura (950 μl) sotto gli inserti.
2. Conservare le colture di fette organotipiche in un incubatore per colture tissutali (35 °C, 5% di CO₂) e sostituire i terreni di coltura per fette ogni due giorni.

2. Preparazione del plasmide

1. Prepara il plasmide per il gene di interesse.
   1. Subclonare il gene della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) in un vettore pCAG.
   2. Purificare il plasmide pCAG-EGFP con un kit di purificazione privo di endotossine e scioglierlo in una soluzione interna costituita da acqua trattata con dietil pirocarbonato contenente 140 mM di K-metansolfonato, 0,2 mM di acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 2 mM di MgCl₂ e 10 mM di HEPES, regolato a pH 7,3 con KOH (concentrazione plasmidica: 0,1 μg/μL).

3. Preparazione della pipetta in vetro

1. Tirare le pipette in vetro borosilicato (4,5 – 8 MΩ) su un estrattore per micropipette (Figura 1A).
   NOTA: Le pipette in vetro utilizzate per le registrazioni con pinza patch a cellula intera sono ideali per l'elettroporazione.
2. Cuocere le pipette di vetro per una notte a 200°C per sterilizzarle.
3. Controllare le dimensioni della punta della pipetta al microscopio da dissezione per approssimare la resistenza elettrica.
   1. Opzionale:Verifica la resistenza della pipetta collegando la pipetta all'elettrodo di elettroporazione e usa il micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sterilizzato con filtro contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ e 11 glucosio in acqua deionizzata, gassata con 5% CO₂/95% O₂ a un pH di 7.4. Confermare la resistenza effettiva utilizzando la lettura sull'elettroporator.
      NOTA: Più affilata è la punta della pipetta, maggiore è la resistenza elettrica. La resistenza della pipetta deve essere inferiore a 10 MΩ. Le pipette in vetro con elevata resistenza alla pipetta (Figura 1B) spesso si intasano sul puntale durante l'elettroporazione ripetuta.

4. Configurazione dell'impianto di elettroporazione

1. Installare l'elettroporatore in un impianto di elettrofisiologia standard a cellule intere, dotato di un microscopio verticale montato su un tavolo mobile, un micromanipolatore e una pompa peristaltica.
2. Installare lo stadio principale dell'elettroporatore su un micromanipolatore e collegare una coppia di altoparlanti all'elettroporatore. Collegare l'elettroporatore a un pedale che può essere utilizzato per inviare un impulso quando è pronto.
   NOTA: Gli altoparlanti emettono un segnale acustico quando sono accesi, che è un indicatore della resistenza elettrica all'elettrodo. Ciò consente di determinare le variazioni relative della resistenza senza distogliere l'attenzione dalla procedura.

5. Preparazione dell'elettroporazione

1. Trasferisci gli inserti di coltura a fette da piastre a 6 pozzetti a piastre di Petri da 3 cm caricate con 900 μL di terreno di coltura e conservate in un incubatore a CO₂ da tavolo fino al momento di eseguire l'elettroporazione.
   1. Preincubare gli inserti di coltura freschi con terreni di coltura a fette (1 mL) per almeno 30 minuti in una piastra di Petri da 3,5 cm per coltivare le fette dopo l'elettroporazione.
2. Pulire e preparare il rig per l'elettroporazione.
   1. Perfondere le linee con il 10% di candeggina per 5 minuti per sterilizzare il tubo e la camera prima di iniziare l'esperimento per la giornata.
   2. Perfondere le linee con acqua autoclavata deionizzata per almeno 30 minuti per risciacquare completamente.
   3. Perfondere le linee con aCSF sterilizzato con filtro contenente 0,001 mM di tetrodotossina (TTX).
      NOTA: TTX riduce al minimo la tossicità cellulare e la morte dovuta alla sovraeccitazione degli interneuroni.
3. Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroporatore: ampiezza di 5 V, impulso quadrato, treno di 500 ms, frequenza di 50 Hz e larghezza dell'impulso di 500 μs.
4. Riempire la pipetta di vetro con 5 μL di soluzione interna contenente plasmidi.
   1. Rimuovi eventuali bolle d'aria intrappolate dalla punta della pipetta sfiorando e picchiettando delicatamente la punta più volte.
   2. Controllare che il puntale non sia danneggiato visualizzandolo al microscopio da dissezione o ripetendo il passaggio 3.3.1 per verificare la resistenza della pipetta.
      NOTA: Se il puntale è danneggiato, la pipetta di vetro deve essere scartata e questo passaggio deve essere ripetuto con una nuova pipetta di vetro precedentemente preparata nel passaggio 3.
5. Fissare saldamente la punta della pipetta all'elettrodo e accendere gli altoparlanti. Registrare la lettura (la resistenza della pipetta) dell'elettroporatore quando il puntale è entrato in contatto con il mezzo aCSF.
6. Tagliare la membrana dell'inserto di coltura utilizzando una lama affilata e isolare una fetta di coltura. Trasferire con cura la coltura a fette nella camera di elettroporazione utilizzando una pinza ad angolo acuto e fissarne la posizione con un'ancora a fette.
   1. Non tenere la coltura della fetta fuori dall'incubatrice per più di 30 minuti alla volta per evitare effetti collaterali come cambiamenti nella salute o nella funzione neuronale.

6. Elettroporare le cellule di interesse

1. Applicare una pressione positiva alla pipetta con la bocca o utilizzando una siringa da 1 ml (pressione 0,2 - 0,5 ml) collegata al tubo.
2. Utilizzare i comandi tridimensionali della manopola del micromanipolatore per manovrare la punta della pipetta vicino alla superficie della coltura a fette.
3. Scegli una cellula bersaglio e avvicinati, mantenendo la pressione positiva applicata fino a quando non si forma una fossetta sulla superficie cellulare visibile al microscopio.
4. Eseguire cicli di pressione.
   1. Applica rapidamente una leggera pressione negativa con la bocca in modo che si formi un sigillo allentato tra la punta della pipetta e la membrana plasmatica, indicato visivamente dalla membrana che sale in qualche modo nella punta della pipetta. Osservare un aumento (~2,5 volte la resistenza iniziale) della resistenza della pipetta ascoltando un aumento del tono proveniente dagli altoparlanti. Riapplicare rapidamente la pressione positiva in modo che la fossetta si riformi.
   2. Completare immediatamente almeno altri due cicli di pressione senza pause, quindi mantenere la pressione negativa per 1 s.
      NOTA: Mettere in pausa tra i cicli, applicare troppa pressione o mantenere la pressione negativa troppo a lungo può causare danni significativi alla cella e possibilmente causare la morte della cella durante l'elettroporazione.
5. Pulsare rapidamente l'elettroporatore una volta utilizzando il pedale quando il tono degli altoparlanti raggiunge un apice stabile dell'intonazione, indicando il picco di resistenza elettrica. Non attendere il picco di resistenza per più di 1 s prima di inviare l'impulso.
   NOTA: Non abbiamo osservato alcuna elettroporazione fuori bersaglio quando si utilizza questo protocollo. Sono state trasfettate solo le cellule a contatto con la pipetta di vetro durante i cicli di pressione. Il posizionamento della pipetta vicino ad altri neuroni non provoca la trasfezione genica.
6. Ritrarre delicatamente la pipetta a circa 100 μm dalla cella senza applicare pressione.
7. Riapplicare la pressione positiva, verificando che la resistenza sia simile alla lettura registrata nel passaggio 5.5, quindi avvicinarsi alla cella successiva.
   >
   1. Rimuovi potenziali ostruzioni, indicate visivamente o da una resistenza della pipetta significativamente aumentata (>15% in più) dopo l'elettroporazione, applicando una pressione positiva.
      >NOTA: Se non c'è intasamento visibile e la resistenza è ancora significativamente più alta, scarta la pipetta e usane una nuova. In media, una pipetta può essere utilizzata per un massimo di 20 eventi di elettroporazione se l'utente presta attenzione.
8. Dopo l'elettroporazione, trasferire la coltura a fette su un inserto di coltura fresco e incubare a 35°C nell'incubatore per un massimo di 3 giorni.

Risultati

Figura 1: Due immagini rappresentative di pipette di vetro. (A) Visualizzare pipette a resistenza inferiore (6,5 MΩ), utilizzate in questo protocollo, e (B) pipette a resistenza superiore (10,4 MΩ) tipiche ...

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