Iniezione di peptidi autoassemblanti e cellule precursori neurali per la riparazione del midollo spinale in un modello di ratto

Abstract

Fonte: Zweckberger, K., et al. Uso sinergico di cellule precursori neurali e peptidi autoassemblanti nella lesione sperimentale del midollo spinale cervicale. J. Vis. Exp. (2015).

Questo protocollo dimostra un approccio iniettivo mirato per la riparazione delle lesioni del midollo spinale in un modello di ratto. Prevede la somministrazione di peptidi autoassemblanti (SAP) nel nucleo della lesione per creare un'impalcatura di supporto, seguita da iniezioni di cellule precursori neurali (NPC) attorno alla lesione per rimodellare il tessuto.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Modello di contusione/compressione con clip per aneurisma cervicale

1. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare in autoclave gli strumenti e mantenerli sterili durante l'intera procedura chirurgica immergendoli in un bagno alcolico al 70%.
2. Anestetizzare i ratti Wistar (250-270 g) con una combinazione di ossigeno (O₂), protossido di azoto (N₂O) (1:1) e isoflurano all'1,8-2,2% e sostenere la respirazione spontanea tramite una maschera per anestesia gassosa. Per l'induzione dell'anestesia, iniziare con isoflurano al 5% per 1 minuto e ridurre successivamente. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, controllare la profondità dell'anestesia somministrando uno stimolo doloroso (ad esempio, alle zampe). Applicare unguenti grassi negli occhi per evitare la secchezza e prevenire successive infezioni.
3. Mettere i ratti su un cuscino riscaldante (37 °C) e fissare la testa in un telaio stereotassico.
4. Radere la regione chirurgica intorno al rachide cervicale e disinfettare con iodio povidone e alcol al 70%.
5. Praticare un'incisione sulla linea mediana sopra la colonna vertebrale dalla vertebra cervicale (C2) raggiungendo il processo prominente del corpo vertebrale toracico 2 (T2).
6. Taglia lo strato esterno dei muscoli vertebrali direttamente sulla linea mediana (per evitare sanguinamenti) in direzione cranio-caudale e seziona ulteriormente gli strati muscolari più profondi senza mezzi termini fino a raggiungere il processo spinoso e le lamine. Inserire i divaricatori.
7. Orientare il prominente processo spinoso del corpo vertebrale T2 per osservare i livelli mirati per la laminectomia. Dopo l'identificazione e la preparazione microchirurgica delle lamine selezionate, tagliare i ligamenti flavae per allentare le lamine e il processo spinoso. Infine, tagliare le lamine con un tagliaossa lateralmente al midollo spinale e rimuoverle delicatamente, evitando qualsiasi compressione del midollo spinale stesso.
   NOTA: I livelli più comuni sono C5/6, C6/7 o C7/T1. Il tasso di mortalità perioperatoria aumenta quanto più rostrale è il livello di lesione. Il sanguinamento dal seno venoso paravertebrale è comune e può essere affrontato con un'attenta compressione con una spugna.
8. Prima di inserire la clip per traumatizzare il midollo, identificare le radici nervose emergenti per evitare che si aggancino (soprattutto ai livelli C5/6).
9. Per garantire un'induzione regolare della clip, allentare la dura ventrale dal lato dorsale dei corpi vertebrali con un gancio e preparare un corridoio per la clip.
10. Infine, inserire la clip aperta e lasciarla chiudere a scatto (chiusura rapida) per ottenere una lesione da contusione. La forza di chiusura della clip e la durata della chiusura della clip determinano l'intensità del trauma e l'entità della compressione. Comunemente utilizzate sono forze di clip comprese tra 15 e 35 g e una durata di clipping, ad esempio, di 1 min (Figura 1).
11. Dopo aver rimosso la clip, adattare i muscoli in 2 strati e chiudere la ferita.
12. Interrompi l'anestesia e lascia che l'animale si svegli sotto la tua continua osservazione fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per la decubito sternale. Infine, metti il ratto in una gabbia singola e segui le linee guida del trattamento post-operatorio.
13. Poiché gli animali lottano con la gravità di questo tipo di lesione, è necessario prestare particolare attenzione ai trattamenti post-operatori:
    1. Somministrare antidolorifici (Buprenorfina e Meloxicam per 3 giorni e 5 giorni, rispettivamente, e in base ai sintomi clinici).
    2. Somministrare ulteriore soluzione salina per via sottocutanea per 3 giorni (2 volte al giorno, 5-10 millilitri (ml)).
    3. Fornire antibiotici nell'acqua potabile 2 giorni prima e fino a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico (ad es. Moxifloxacina)
    4. Spremere la vescica urinaria 2-3 volte al giorno fino a quando il recupero della funzione vescicale è costantemente evidente.
    5. Osservare i deficit neurologici e le condizioni fisiologiche degli animali operati almeno una volta al giorno.

2. Iniezione di SAP e NPC (14 giorni dopo l'infortunio)

1. Indurre l'anestesia come descritto nei punti da 1.1 a 1.3, fissare la testa del ratto in un telaio stereotassico, rimuovere i punti o le clip della ferita e disinfettare la ferita e l'area chirurgica con iodio povidone e alcol al 70%.
2. Sezionare con cura i muscoli paravertebrali, inserire i divaricatori, rimuovere microscopicamente il tessuto cicatriziale dalla dura madre e riesporre il sito della lesione.
3. Preparare i SAPs in una concentrazione dell'1% (p/v) per eseguire un gel di matrice extracellulare. I SAPs QL6 hanno un pH fisiologicamente compatibile e non devono essere tamponati prima dell'iniezione. Per la visualizzazione dei SAPs nel midollo spinale, utilizzare un derivato fluorescente di QL6 (QL6-fluoresceina isotiocianato [FITC]).
4. Iniettare SAPs (5 microlitri (μl) al centro della lesione, distribuiti in 2 porzioni, ciascuna da 2,5 μl bilateralmente della linea mediana. Utilizzare una siringa Hamilton collegata al telaio stereotassico con un capillare in micro vetro (diametro esterno [OD] di 100 micrometri (μm)). Aprire con cautela la dura madre con la punta di un ago affilato e inserire il capillare di vetro stereotassicamente di 2 millimetri (mm) nel midollo spinale traumatizzato.
5. Dopo aver iniettato 1/3 del volume, rimuovere l'ago a una profondità di 1,5 mm e dopo un ulteriore 1/3-1 mm. Dopo l'iniezione dell'intero volume e prima di rimuovere la siringa, attendere 5 minuti per stabilizzare la formazione del gel.
6. Per generare NPC, utilizzare topi adulti con proteina fluorescente rossa del discosoma (DsRed) (o topi positivi alla proteina fluorescente gialla [YFP], verdi) e isolarli e coltivarli dalla zona paraventricolare.
7. Valutare la vitalità delle NPC mediante colorazione con Trypan Blue, che indica la presenza di ~90% di cellule vive nella sospensione cellulare. Diluire le cellule in un terreno di crescita (50 x 10³ cellule vive/μl) e poi utilizzarle per il trapianto di cellule.
8. Effettuare quattro iniezioni intraspinali da 2 μl (8 μl di volume totale, contenente 4 x 10⁵ NPC) bilateralmente a 2 mm rostrale e caudale del sito della lesione. Dopo aver aperto la dura, inserire il capillare in microvetro di Hamilton 1,5 mm sotto la superficie dorsale del midollo spinale e iniettare 2 μl di sospensione cellulare. Scegliere una velocità di iniezione di circa 0,5 μl/min (min).
9. Al termine di ogni iniezione e prima di rimuovere il capillare dal cordone, attendere almeno 1 minuto, consentendo l'allungamento del tessuto per accogliere il nuovo volume cellulare. (Figura 2)

Results

Figura 1: Modello di aneurisma di contusione/compressione della clip. (A) Fotografare al microscopio operatorio dopo la laminectomia di C7/T1 e clip la contusione/compressione del midollo spinale di un ratto. (B...

Materials