Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali per la transizione dal sonno alla veglia nei topi

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Chirurgia animale, iniezione di virus, elettrodo per EEG/EMG e impianto di fibre ottiche

ATTENZIONE: le tecniche di protezione e manipolazione appropriate devono essere selezionate in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. Il virus adeno-associato (AAV) deve essere utilizzato in una stanza isolata di grado P1A per l'iniezione e la provetta contenente AAV deve essere sterilizzata con un'autoclave dopo che tutto il volume è esaurito. Il sito chirurgico e tutto il materiale impiantato devono essere puliti e sterili durante l'uso.

NOTA: Vedere la Figura 1.

1. Disinfettare l'attrezzatura chirurgica con l'autoclave.

2. Anestetizzare i topi con isoflurano usando un vaporizzatore anestetico. Osservare fino a quando il topo non ha raggiunto la profondità di anestesia desiderata, determinata dalla perdita di risposta al pizzicamento della coda con una pinza. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino.

3. Disinfettare il campo chirurgico con una soluzione di iodio o etanolo al 70% (EtOH, 3x) e asciugare a sufficienza. Lasciare che il virus si scongeli con il ghiaccio durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. Coprire l'area chirurgica con carta assorbente da banco da laboratorio.

4. Fissare la testa del mouse nell'apparato stereotassico con le barre auricolari e un pizzico per il naso. Dopo aver confermato che la testa è tenuta in modo stabile, praticare un'incisione sagittale medio nel cuoio capelluto per assicurarsi che le posizioni della bregma e della lambda si trovino allo stesso livello su una linea orizzontale.

5. Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare in modo appropriato i livelli del pizzico del naso e delle barre auricolari su e giù. La bregma e la lambda si riferiscono all'intersezione tra la sutura saggitalis e la sutura coronalis o sutura lambdoidale, rispettivamente (Figura 2).

6. Utilizzare i morsetti Serafin per tenere la pelle e mantenere l'accesso al cranio. Dopo l'esposizione del cranio, disinfettare la superficie del cranio con iodio o 5% H₂O₂, per consentire una visualizzazione più chiara delle suture craniche, compresi il bregma e la lambda.

7. Prepara l'iniezione del vettore AAV:

1. Lavare l'interno di una siringa da 10 ml (vedere la Tabella dei materiali) in sequenza con EtOH al 70%, EtOH al 100% e acqua sterilizzata, 5 volte ciascuna. Fissare la siringa nel morsetto del braccio di una pompa per microiniezione e assicurarsi che tutta la soluzione contenuta nella siringa sia scaricata.

2. Aspirare con cura 2 μL di olio minerale senza bolle d'aria, quindi aspirare il volume designato della soluzione virale. Dopo l'aspirazione, manipolare il pulsante dello stantuffo e verificare che la soluzione virale emerga sulla punta dell'ago.

NOTA: Il volume di iniezione della soluzione virale è stato determinato in esperimenti pilota utilizzando lo stesso ceppo di topo e lo stesso prodotto virale. La relazione tra il volume della soluzione virale e l'estensione dell'area di infezione deve essere stimata in anticipo.

8. Inietta vettore AAV:

1. Regolare la punta dell'ago per microiniezione sul bregma e annotare le coordinate come punto originale. Spostare la punta nel sito di iniezione designato (per la BNST: anteroposteriore + 0,2 mm, mediolaterale ± 1,0 mm, dorsoventrale - 4,2 mm) e posizionare la punta dell'ago in questa posizione. Metti un segno sul cranio e pratica dei fori di circa 2 mm di diametro usando un trapano dentale con una fresa in metallo duro da 0,7 mm. Fare attenzione a non danneggiare la dura madre o il tessuto cerebrale.

2. Dopo aver rimosso il sangue intorno ai fori con un batuffolo di cotone, sposta lentamente l'ago nella posizione del BNST. Iniettare lentamente la quantità designata di soluzione virale (0,07 μl/min) con un microiniettore meccanico. Dopo aver completato l'iniezione, lasciare l'ago per 5 minuti per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST. Rimuovere con cautela l'ago.

3. Per le iniezioni bilaterali, ripeti i passaggi 1.8.1-1.8.2 dall'altro lato. Durante la procedura, applicare soluzione fisiologica sterile per mantenere umido il cranio.

NOTA: Abbiamo utilizzato impianti personalizzati per elettroencefalografia (EEG)/elettromiografia (EMG) (larghezza: 5 mm, profondità: 7 mm, altezza: 1 mm) con quattro elettrodi EEG (4 mm), due elettrodi EMG (2 mm; tagliare l'elettrodo da 4 mm a 2 mm con una tronchesina) e 6 elettrodi (4,5 mm) (Figura 2A).

9. Saldare due fili di acciaio inossidabile (vedi Tabella dei materiali) da cui 1 mm di isolamento viene strappato da entrambe le estremità agli elettrodi EMG. Regolare il centro degli elettrodi sulla bregma, segnare la posizione di ciascun elettrodo EEG (anteroposteriore ± 1,5 mm, mediolaterale ± 1,0 mm) e determinare la posizione dell'impianto (Figura 2B).

10. Fibre ottiche per impiantare:

1. Collegare una ghiera in fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio del manipolatore in modo che abbia un angolo di ±30° contro una linea orizzontale (questo processo è necessario solo per evitare interferenze tra elettrodi e fibre ottiche, come nel caso della stimolazione BNST). Metti la punta della fibra sulla bregma e registra le coordinate.

2. Sposta la punta sulla linea di inserimento mirata e segna la posizione sul teschio. Inoltre, mettere ulteriori segni vicino al sito di inserimento per le viti di ancoraggio. Forare il cranio in ogni sito con un trapano dentale per inserire la fibra ottica e fissare la vite. Fissa la vite sul cranio. Fare attenzione a non rompere la dura madre o danneggiare alcun tessuto con la vite.

3. Inserisci delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere il BNST con un manipolatore. La ghiera deve poggiare sul cranio rimanente (Figura 1B).

4. Applica del cemento dentale fotopolimerizzabile (vedi Tabella dei Materiali) per coprire la fibra e la vite. Il tempo di reazione per solidificare la colla deve essere specificato dal manuale del produttore (il nostro materiale necessita di esposizione alla luce per almeno 10 secondi con fotogeneratori a lunghezza d'onda specifica. Non è necessario asciugare la colla dopo questo).

5. In questo passaggio, assicurati che nessun materiale (viti o colla) occupi lo spazio di montaggio per gli elettrodi. Inoltre, evitare di effettuare alcuna interruzione nel cemento per la ghiera di collegamento alla fibra ottica e al cavo. Ripetere i passaggi 1.10.1-1.10.4 sul lato opposto per la stimolazione bilaterale.

11. Praticare i fori per gli elettrodi EEG/EMG. Inserire le punte degli elettrodi nei fori. Tenere l'impianto e applicare l'adesivo cianoacrilato sullo spazio tra il cranio e gli elettrodi. Reinserire facendo attenzione a non interferire con alcun materiale.

12. Coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato, seguito dall'applicazione di accelerante cianoacrilato sull'adesivo. Questo passaggio evita di causare interruzioni nella zona di collegamento tra boccola e cavo ottico e tra elettrodo e filo conduttore (Figura 1C).

NOTA: L'adesivo cianoacrilato e il suo accelerante sono dannosi per l'occhio del mouse. Prestare attenzione a non causare fuoriuscite di queste sostanze chimiche. Inoltre, fare attenzione a non toccare con forza gli elettrodi e le fibre per evitare deviazioni impreviste subito dopo la solidificazione dell'adesivo.

13. Esporre i muscoli del collo del mouse e inserire i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si trovi appena sotto i muscoli nucali. Una leggera connessione tra la punta dell'elettrodo e la fascia muscolare è sufficiente per catturare il segnale EMG.

14. Applicare l'adesivo cianoacrilato per riempire gli impianti e solidificare l'adesivo con il liquido di accelerazione. Quindi, metti il mouse su un termoforo per il recupero fino a quando non appare il riflesso posturale. Regolare la temperatura del termoforo in base alla temperatura corporea dell'animale a riposo (36,0 °C in ZT 0-12 nel caso di topi C57BL6; non superare i 38,0 °C).

NOTA: Non è necessario un antibiotico per la chirurgia sterile. Segui le linee guida istituzionali locali per l'analgesia post-operatoria. Tenere i topi in una gabbia domestica per un periodo di recupero di almeno 7 giorni.

2. Monitoraggio EEG/EMG con fotoeccitazione di neuroni mirati in specifici stati di sonno

ATTENZIONE: Questo protocollo include l'uso di apparecchiature laser di classe 3B o dispositivi LED. Gli sperimentatori devono essere a conoscenza delle informazioni sulla sicurezza. Sono necessari occhiali protettivi.

1. Prima di collegare il cavo laser alla fibra ottica, regolare l'intensità del laser con un ablatore. Fissare la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata con una ghiera e verificare che non vi sia spazio all'incrocio tra la fibra e il cavo.

2. Accendere l'interruttore principale del laser e attendere 20 minuti affinché si riscaldi.

3. Emettere il laser sul controllo dell'intensità e regolare l'intensità del laser a 10 mW/mm². Cambia la modalità laser in logica a transistor e conferma che gli impulsi luminosi vengono emessi dalla fibra controllata dal regolatore del modello, che è impostato a 10 ms per la durata, 40 ms per il riposo, 20 volte per il ciclo e 20 volte la ripetizione (ovvero, 20 Hz di impulsi luminosi da 10 ms per 20 s).

4. Trascorso il periodo di recupero, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione EEG/EMG. I topi domestici sono stati mantenuti a una temperatura costante di 23 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore con cibo e acqua disponibili ad libitum.

5. Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore per cavo che è legato a un anello di contatto per evitare l'impigliamento. Si consiglia di coprire la giunzione con materiale impermeabile alla luce come un foglio di alluminio per evitare perdite laser. Se è necessario un esperimento bilaterale, utilizzare un collettore rotante con un attacco biforcato per i cavi.

6. In questo protocollo, valutiamo la latenza alla veglia dal sonno NREM (NREM) o REM, quindi il tempo di registrazione dovrebbe essere limitato nel tempo zeitgeber ottimizzato (ZT0 è definito come il tempo in cui la luce è accesa). Questo protocollo è stato condotto tra ZT4 e ZT10. Lasciare che i topi rimangano liberamente nella camera sperimentale per almeno 1 ora come acclimatazione.

7. Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nello stesso monitor e valutare lo stato del topo come veglia, sonno NREM o sonno REM. Utilizzare il controllo del guadagno per ogni onda per facilitare la distinzione di ogni stato.

8. Per misurare la latenza tra sonno NREM e veglia, osservare il sonno NREM stabile per 40 s o il sonno REM stabile per 30 s, quindi accendere l'interruttore del generatore di pattern per la fotostimolazione (questo protocollo genera 20 Hz di impulsi luminosi da 10 ms per 20 s). Confermare l'emissione laser alle fibre ottiche impiantate.

9. Registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato di sonno non cambia in veglia. Se sono necessari due o più studi sperimentali, limitare la manipolazione optogenetica a una volta al giorno perché la fotostimolazione è un intervento artificiale che potrebbe influenzare l'architettura del sonno/veglia.

10. Dopo l'esperimento, anestetizzare profondamente e perfondere con soluzione fisiologica sterile e paraformaldeide (PFA) per il campionamento dell'intero cervello per l'analisi immunoistochimica.

Figura 1: Procedura per iniettare AAV, fibre ottiche per impianti e impianti EEG/EMG. (A) Procedura sperimentale di iniezione del virus. Il gene ChR2 o EYFP (per il controllo) fuso con EYFP incorporato in un vettore AAV la cui trascrizione è attivata dalla ricombinasi Cre è stato iniettato bilateralmente nel BNST. (B) Le fibre ottiche sono state inserite verso il BNST con un angolo di 30° rispetto all'orizzontale per evitare la collisione con l'elettrodo. Attorno ad esso sono state inserite due viti. (C) Un dispositivo di registrazione EEG/EMG è stato impiantato dopo il posizionamento sicuro delle fibre ottiche. (D) Al termine dell'operazione, l'intera area chirurgica deve essere coperta con adesivo cianoacrilato e fissata saldamente. Assicurarsi di non applicare alcun agente sulla regione che collega l'elettrodo e le boccole.

Figura 2: Siti di inserimento di elettrodi EEG/EMG personalizzati e pin di elettrodi. (A) In alto: Su 6 pin dell'elettrodo, i due pin esterni sono tagliati a 2 mm. In basso: elettrodi EEG/EMG. (B) Questi elettrodi e fili di conduzione EMG vengono quindi saldati. La zona di connessione deve essere isolata con qualsiasi isolante, come l'adesivo cianoacrilato. I siti di inserimento degli elettrodi sono relativi alla bregma (anteroposteriore ± 1,5 mm, mediolaterale ± 1,0 mm). I fili EMG vengono inseriti sotto il muscolo del collo con la rimozione dell'isolamento che protegge il filo nel sito di inserimento (1 mm).