Stimolazione del nervo vago tramite elettrodi della cuffia del nervo periferico impiantati cronicamente nei ratti

Abstract

Fonte: Sanchez, C. A., et al. Preparazione di elettrodi di stimolazione del nervo periferico per l'impianto cronico nei ratti. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la stimolazione del nervo vago in un ratto sveglio. Un ratto con un elettrodo impiantato nella cuffia del nervo periferico cronico e addestrato in un compito di pressa a leva è collegato a un generatore di stimolo tramite un cappuccio impiantato. Il nervo vago viene stimolato immediatamente dopo ogni pressione riuscita della leva, con conseguente espansione della mappa motoria.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Stimolare la fabbricazione dell'elettrodo del bracciale

1. Preparare il tubo del bracciale.
   1. Usando una lama di rasoio, taglia un pezzo di tubo polimerico lungo 2,5 mm. Inserire le punte delle pinze o una graffetta attraverso il tubo e utilizzare la lama per praticare una fessura longitudinale attraverso la parete del tubo su un lato del bracciale.
   2. Rimuovere la pinza dal tubo e inserire un grande ago da cucito attraverso la linea mediana del bracciale, perpendicolare all'asse lungo. Inserire l'ago attraverso la fessura (in alto) e al centro del tubo di fronte (in basso). Posizionare l'ago nel pannello di schiuma per fissare il bracciale in posizione durante le restanti fasi di assemblaggio.
2. Posizionare una sutura per fissare la chiusura della cuffia durante l'impianto.
   1. Inserisci l'ago da cucito piccolo attraverso la parete del polsino, sulla linea mediana, a circa 0,5 mm dalla fessura superiore su un lato. Inserire l'ago dall'interno verso l'esterno per evitare di danneggiare il tubo del bracciale. Inserire una sutura 6/0 di 2 cm di lunghezza attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete del tubo per infilare la sutura nel bracciale.
   2. Lasciando il filo in posizione, rimuovere l'ago e praticare un secondo foro attraverso la parete del tubo a circa 0,5 mm sotto il primo foro, lungo la linea mediana del bracciale. Inserire la sutura attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete del tubo per infilare nuovamente la sutura attraverso il bracciale.
   3. Entrambe le estremità del filo di sutura dovrebbero ora trovarsi sul lato esterno del bracciale. Regolare la sutura in modo che ~1,5 cm si estenda dal foro superiore e ~0,5 mm si estenda dal foro inferiore.
   4. Applicare una piccola quantità di adesivo a polimerizzazione UV (ultravioletta) sull'estremità corta della sutura che si estende dal foro inferiore e tirare l'estremità della sutura più lunga fino a quando la coda inferiore non è quasi a filo con la parete esterna del tubo. Usa la bacchetta UV per polimerizzare l'adesivo e tenere saldamente in posizione la sutura.
   5. Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.3 sul lato opposto del bracciale.
3. Posizionare i cavi del filo Platino:Iridio (Pt:Ir).
   1. Usa l'ago da cucito piccolo per fare 4 fori nella parete del polsino. Ogni coppia di fori deve essere posizionata a circa 0,5–0,8 mm dalla linea mediana perpendicolare, con un foro a circa 0,5–0,8 mm dalla fessura superiore su entrambi i lati del bracciale.
      ATTENZIONE: Per un posizionamento più coerente e accurato delle cavite, inserire l'ago dall'interno verso l'esterno per praticare tutti i fori, utilizzando il posizionamento della sutura come guida.
   2. Inserisci di nuovo l'ago da cucito, questa volta lavorando dall'esterno verso l'interno attraverso il foro di piombo 1. Inserire circa 0,5 cm di un filo Pt:Ir lungo 7,5 cm attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare il cavo del filo attraverso la parete del bracciale. Regolare il filo in modo che ~4,5 cm si estenda sul lato esterno del bracciale (Figura 1A).
   3. Inserire nuovamente l'ago attraverso il foro di derivazione 1, sempre lavorando dall'esterno verso l'interno, e inoltre inserire l'ago attraverso il foro di derivazione 2 direttamente di fronte al foro di derivazione 1. Inserire ~0.5 cm dell'estremità più corta (interna) del filo Pt:Ir attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare il cavo del filo attraverso le pareti del bracciale.
      NOTA: Entrambe le estremità del filo Pt:Ir dovrebbero ora trovarsi sul lato esterno del bracciale e si forma un anello di filo attorno al bordo della fessura e attraverso il foro del cavo 1 (Figura 1B).
   4. Ripetere i passaggi da 1.3.1 a 1.3.3 per posizionare il filo Pt:Ir attraverso i fori conduttori 3 e 4.
   5. Utilizzando un accendino a butano, rimuovere con cautela l'isolamento da una lunghezza di 5-6 mm all'estremità dei fili Pt:Ir che si estendono dal foro di derivazione 2 e dal foro di derivazione 4.
      ATTENZIONE: Isolare accuratamente le estremità dei cavi dal resto del gruppo del bracciale per evitare di danneggiare il bracciale. Utilizzare strumenti per tenere i fili per evitare lesioni.
   6. Allineare il filo nudo all'interno del bracciale per posizionare gli elettrocateteri nelle loro posizioni finali. Per fare ciò, tirare delicatamente l'estremità del filo Pt:Ir che si estende dal foro 1 fino a quando la parte non isolata del filo non è a filo con il foro 1. Ripetere con l'altro cavo per allineare l'estremità non isolata del filo infilata attraverso i fori 3 e 4.
   7. Applicare una piccola quantità di adesivo a polimerizzazione UV sugli anelli di filo sul lato esterno del bracciale in corrispondenza dei fori di derivazione 1 e 3. Usa la bacchetta UV per polimerizzare l'adesivo e fissare i cavi in posizione.
   8. Utilizzare una piccola punta per pipetta per spingere i cavi del filo Pt:Ir non isolati contro la parete interna del bracciale. Una volta posizionati i cavi, tagliare le estremità dei fili che si estendono dai fori 2 e 4 in modo che circa 1 mm di filo si estenda oltre l'esterno della parete del bracciale.
   9. Piegare le estremità di 1 mm del filo contro la superficie esterna del bracciale, facendo attenzione a non accorciarle insieme. Applicare una piccola quantità di adesivo a polimerizzazione UV per coprire solo le due code e polimerizzare l'adesivo per fissare il posizionamento del piombo e fornire isolamento elettrico.
      ATTENZIONE: È importante coprire completamente le superfici Pt:Ir esposte esternamente con adesivo per isolare i fili ed evitare la stimolazione fuori bersaglio.
4. Fissare i cavi Pt:Ir in posizione con il fissaggio della sutura.
   1. Rimuovi l'ago grande con il gruppo del bracciale dal pannello di gommapiuma. Inserire una sutura 6/0 di 3 cm di lunghezza attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare la sutura attraverso la parte inferiore del bracciale nel punto medio.
   2. Passa all'ago da cucito piccolo per completare l'infilatura della sutura per il fissaggio dell'elettrocatetere Pt:Ir. Inserire l'ago attraverso lo stesso foro della linea mediana, lavorando di nuovo dall'interno verso l'esterno per evitare la deformazione del tubo e dei conduttori. Inserire la coda esterna della sutura attraverso la cruna dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete della cuffia per creare un anello di sutura attorno al bordo della cuffia (Figura 1C).
      NOTA: Utilizzare una pinza e lavorare al microscopio per assicurarsi che la sutura sia orientata lungo l'asse lungo della cuffia e poggi piatta contro il tubo. Questo passaggio assicura che gli elettrocateteri rimangano separati sul lato interno del bracciale e siano tenuti in posizione lateralmente alla linea mediana del gambetto.
   3. Crea un secondo anello attorno all'estremità opposta del bracciale legando le estremità della sutura in un mezzo nodo, sul lato esterno del bracciale. Assicurarsi che la sutura scorra lungo l'asse lungo della cuffia e poggi piatta contro il tubo. Tenendo stretto il nodo in modo che sia piatto contro il tubo, applicare una piccola quantità di adesivo UV sul mezzo nodo e polimerizzare per tenerlo in posizione.
   4. Tagliare con cura le estremità del filo di sutura il più vicino possibile al nodo. Se necessario, utilizzare una piccola quantità di adesivo UV aggiuntivo per incollare le estremità corte della sutura in modo che siano piatte contro il tubo (Figura 1D).
5. Saldare i pin del connettore ai conduttori del filo Pt:Ir.
   1. Usando un accendino a butano, rimuovi l'isolamento da ~3 mm all'estremità di ciascuno dei cavi Pt:Ir. Saldare il lato della coppa di un perno d'oro (vedi Tabella dei materiali) all'estremità non isolata di ciascun cavo.
6. Testare l'impedenza del dispositivo assemblato.
   1. Collega i pin d'oro agli ingressi di un misuratore LCR (Induttanza (L), Capacità (C) e Resistenza (R)) o di un modulo di controllo dell'impedenza dell'elettrodo e imposta la frequenza di prova a 1 kHz. Immergere il tubo della cuffia (e i contatti di stimolazione Pt:Ir all'interno della cuffia) in un piccolo becher riempito di soluzione fisiologica, facendo attenzione a mantenere asciutti i pin di piombo dorati e i connettori della sonda. Verificare che la cuffia assemblata abbia un'impedenza a 1 kHz inferiore a 2 kΩ prima di procedere con l'impianto.
      NOTA: Un'alta impedenza spesso indica un'area di superficie Pt:Ir inadeguata esposta, che può verificarsi a causa di fattori quali rimozione insufficiente dell'isolamento, applicazione accidentale di adesivo all'interno della cuffia, trefoli di filo rotti, and so on. I polsini devono anche essere ispezionati per verificare la presenza di trefoli di filo rotti o posizionati male che potrebbero causare contatti in cortocircuito con l'uso a lungo termine.

2. Costruzione del copricapo

NOTA: Le procedure di montaggio del copricapo sono simili a quelle pubblicate in precedenza e sono riassunte qui per comodità.

1. Assembla il copricapo
   1. Taglia due piccoli pezzi di filo da 30 AWG (American Wire Gauge), uno di ~13 mm di lunghezza e uno di ~10 mm di lunghezza. Spelare ~1,5 mm di isolamento da ciascuna estremità di entrambi i fili. Saldare il lato del pin di un pin d'oro a un'estremità di ciascun filo, il più vicino possibile alla tazza. Utilizzare tronchesi per tagliare la lunghezza in eccesso del perno oltre il giunto di saldatura.
   2. Saldare le altre estremità dei fili AWG alle due coppe di saldatura centrali di un connettore a microstriscia a 4 pin.
   3. Piegare le derivazioni del coprifilo verso l'alto verso il connettore e posizionare i pin dorati in piano contro il connettore, paralleli tra loro, come mostrato nella Figura 2A. Il pin collegato al filo più corto deve essere posizionato sotto il pin collegato al filo più lungo. Utilizzare acrilico per unghie, cemento dentale o adesivo a polimerizzazione UV per fissare in posizione i cavi del copricapo.

3. Utilizzo del dispositivo

1. Impiantare gli elettrodi della cuffia per la stimolazione cronica del nervo vago.
   NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite utilizzando una tecnica sterile o asettica in anestesia appropriata, in conformità con le linee guida NIH (National Institutes of Health) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e con l'approvazione locale dell'IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). Le seguenti procedure hanno lo scopo di illustrare un uso rappresentativo del dispositivo e non intendono essere esaustive.
   1. Posiziona il ratto in una cornice stereotassica e fai un'incisione sagittale sulle ossa parietali e occipitali per rivelare la superficie del cranio per l'impianto della cuffia/connettore. Praticare con cura 4 fori nel teschio e posizionare le viti del gioielliere. Usa l'acrilico dentale per fissare il cappello al cranio e alle viti.
   2. Rimuovi il ratto dal telaio stereotassico e adagialo sul lato destro. Praticare un'incisione verticale nella pelle sul lato sinistro del collo e sezionare con cura il nervo vago sinistro dall'arteria carotide, situata tra i muscoli sternomastoideo e sternoioide e sotto il muscolo omoioideo.
   3. Il tunnel del bracciale conduce sottocutaneamente verso il cranio. Collegare i cavi al copricapo utilizzando i perni dorati.
   4. Posizionare il nervo vago all'interno della cuffia e fissare il dispositivo chiudendolo facendo un doppio nodo nelle suture della cuffia. Fare attenzione a non danneggiare il nervo durante l'impianto manipolando il nervo con ganci smussati e non conduttivi o afferrando il tessuto connettivo che circonda il nervo.
   5. Testare l'impianto applicando la stimolazione al dispositivo (10 s di 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs impulsi bifasici). Un impianto corretto comporterà l'interruzione della respirazione e un calo della SpO₂ (saturazione di ossigeno capillare periferico) del 5% o più.
   6. Coprire i perni d'oro e gli elettrocateteri esposti con acrilico dentale, chiudere le ferite con punti di sutura e pulire i siti di incisione con soluzione salina, alcol e soluzione di iodio povidone.
   7. Fornire liquidi sostitutivi, analgesici e cure postoperatorie in linea con le linee guida NIH e l'approvazione IACUC.
2. Stimolare il nervo vago durante il comportamento da svegli.
   NOTA: È stato precedentemente dimostrato che la somministrazione di VNS (stimolazione del nervo vago) mentre gli animali eseguono compiti motori specifici per espandere la rappresentazione della mappa motoria della muscolatura rilevante per il compito. Utilizziamo questo paradigma convalidato per fornire un esempio rappresentativo di utilizzo del dispositivo, ma molti altri paradigmi comportamentali e/o parametri di stimolazione possono essere rilevanti per applicazioni alternative. I ratti sono stati addestrati ad essere abili nell'attività di pressa a leva utilizzata qui prima dell'impianto del dispositivo. Dopo l'intervento chirurgico, le buone prestazioni sono state nuovamente verificate prima della somministrazione di VNS: i ratti hanno eseguito almeno 100 prove di successo in due sessioni di allenamento di 30 minuti al giorno. Il VNS è stato abbinato a pressioni corrette della leva durante 10 sessioni di allenamento successive nell'arco di 5 giorni.
   1. Collega il ratto a un generatore di stimoli tramite un cappuccio impiantato e regola le impostazioni di stimolazione appropriate. Per la riorganizzazione indotta da VNS della mappa corticale motoria, accoppiare ogni pressione a leva corretta con un singolo treno di 15 impulsi bifasici, ciascuno con una larghezza di 100 μs e un'ampiezza di 800 μA, erogati a una frequenza di 30 Hz.
   2. Un treno di stimolazione viene erogato immediatamente dopo il rilevamento di ogni pressione riuscita della leva per dieci sessioni di allenamento di 30 minuti. Durante l'erogazione di VNS, utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'erogazione corretta della stimolazione di corrente.
3. Convalidare la funzione della cuffia impiantata cronicamente.
   1. Entro 24 ore dall'ultima sessione di allenamento accoppiata con VNS, usa la microstimolazione intracranica (ICMS) per quantificare la mappa somatotopica funzionale nella corteccia motoria.
   2. Dopo l'induzione dell'anestesia per la mappatura ICMS della corteccia motoria, convalidare nuovamente la funzione della cuffia applicando un treno di 10 secondi di 30 Hz, stimolazione con corrente di 0,8 mA (impulsi bifasici di 100 μs), che dovrebbe comportare una cessazione della respirazione e una riduzione dei livelli di SpO₂ di almeno il 5%, coerente con il riflesso di Hering-Breuer.
      NOTA: A seconda dell'applicazione, la funzione del bracciale può essere considerata accettabile se si osserva una caduta affidabile di SpO₂ inferiore al 5% o se ampiezze di corrente più elevate (fino a 1,6 mA) producono in modo affidabile una riduzione di almeno il 5% di SpO₂. La mancata osservazione di una cessazione della respirazione e/o di una diminuzione affidabile della SpO₂ è indicativa di fallimento dell'impianto.

Risultati

Figura 1: Assemblaggio degli elettrodi stimolanti del bracciale. (A) Dopo aver fissato le suture su entrambi i lati del bracciale, il filo Pt:Ir può essere infilato attraverso la parete del bracciale nel foro #1 (punta di freccia bianca) util...

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