Trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo per la stimolazione uditiva indotta dalla luce

Abstract

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualizzazione diretta del nucleo cocleare dorsale murino per la stimolazione optogenetica della via uditiva. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo (DCN) per consentire la stimolazione uditiva indotta dalla luce. Un vettore virale che codifica per l'opsina, un canale ionico sensibile alla luce, viene iniettato nel DCN dopo una craniotomia e un'aspirazione cerebellare per l'accesso diretto. Le opsine espresse consentono ai neuroni di essere attivati dalla luce, fornendo un modello per lo studio delle risposte del percorso uditivo utilizzando l'optogenetica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Aspirazione cerebellare

1. Utilizzando un'aspirazione a 5 francesi, aspirare la porzione più laterale del cervelletto sinistro sovrastante il DCN fino a quando il DCN non è visivo (Figura 1, pannello destro). Rimuovere circa 1/4 a 1/3 del cervelletto sinistro. Il principale punto di riferimento adiacente al DCN è l'ampolla del canale semicircolare superiore.
   NOTA: L'aspirazione del cervelletto è il passaggio chiave del protocollo. L'aspirazione diretta del cervelletto viene eseguita con maggior successo se avviene in un unico tentativo e non con più passaggi di aspirazione in quanto ciò causerà sanguinamento. Per facilitare l'aspirazione, impostare il piano focale del microscopio alla profondità prevista del CN, che sarà leggermente distale rispetto alla superficie del cervelletto. L'impostazione del piano focale sul CN migliorerà la visualizzazione e garantirà un'immagine nitida.
2. Dopo l'aspirazione, sono previsti ulteriori sanguinamenti, accumulo di liquido cerebrospinale (CSF) e spostamento del cervelletto sul DCN. Instillare rapidamente 0,5 cc di soluzione fisiologica sterile nella craniotomia per prevenire la coagulazione del sangue. Una combinazione di tamponamento delicato con una punta dentale e un'aspirazione può quindi essere utilizzata per liberare un percorso per la visualizzazione diretta del DCN. Non toccare direttamente la superficie del DCN.

2. Microiniezione a pressione per il trasferimento genico mediato da virus e il recupero chirurgico

1. Dopo che il DCN è privo di sangue e liquido cerebrospinale sovrastanti ed è chiaramente visibile, effettuare microiniezioni a pressione nel DCN utilizzando una siringa Hamilton da 10 μl per un periodo di 2 minuti.
2. Introdurre l'ago con un micromanipolatore fino a quando la punta non è più visibile sotto la superficie del DCN.
3. Per prestazioni ottimali, utilizzare un ago calibro 33 o 34 (utilizzare una siringa a tenuta di gas con l'ago calibro 34) con una smussatura poco profonda, ad esempio 45°, per ridurre al minimo il trauma contusivo e localizzare il volume di iniezione all'interno del DCN, che è una struttura del tronco encefalico sottile e poco profonda (<300 μm di spessore).
   NOTA: Possono essere utilizzati altri strumenti di microiniezione. Idealmente, lo strumento di iniezione dovrebbe essere abbastanza flessibile da consentire una leggera flessione, se necessario, per colpire direttamente il DCN. Inoltre, poiché il mouse si muove leggermente durante la procedura a causa della respirazione, lo strumento dovrebbe essere abbastanza robusto da resistere a piccole quantità di movimento.

3. Recupero chirurgico

1. Immediatamente dopo l'iniezione, riapprossimare la pelle e consentire al topo di riprendersi secondo la procedura di recupero standard. Il cervelletto rimanente e il tessuto cicatriziale riempiranno la cavità causata dall'aspirazione del cervelletto. Monitorare costantemente gli animali fino a quando non viene riacquistata una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Monitorare la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria e la capacità di nutrirsi.
   NOTA: Nessun animale che ha subito un intervento chirurgico viene riportato in una gabbia con altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
2. Se un topo inizia a camminare in cerchio dopo l'intervento (<5% dei casi), in genere 2-4 ore dopo la chiusura dell'incisione cutanea, sacrificare immediatamente il topo, poiché probabilmente avrebbe difficoltà ad alimentarsi. Questo effetto collaterale è probabilmente dovuto all'aspirazione del cervelletto. L'animale deve essere monitorato per il dolore dopo l'intervento e devono essere somministrati narcotici appropriati per garantire il comfort dell'animale in base agli standard istituzionali. Gli antibiotici possono essere necessari, se evidenza di infezione.

Risultati

Figura 1: L'aspirazione cerebellare parziale dimostra l'accesso al nucleo cocleare dorsale. Pannello sinistro: dopo che il mouse è stato posizionato nel supporto, viene praticata un'incisione verticalmente attraverso la pelle e i tessuti molli l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporto stereotassico	Stoelting	51500
5 Aspirazione francese	Simmetria Chirurgica	2777914
Punti dentali	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur<	16020-14
10 μl siringa di Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Strumenti Chirurgici di Precisione	16021-14

td colspan='1' rowspan='2'>Strumenti chirurgici fini