Stimolazione del nervo vago in un modello di ratto per ridurre il comportamento di congelamento

Abstract

Fonte: Childs, J. E., et al. La stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità in percorsi rilevanti per l'apprendimento dell'estinzione. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il metodo di stimolazione del nervo vago (VNS) in un modello di ratto per ridurre il comportamento di congelamento. I ratti condizionati dalla paura ricevono VNS durante la riesposizione al suono, portando a una riduzione del congelamento e rivelando il suo potenziale terapeutico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Condizionamento uditivo della paura

NOTA: Questo protocollo di condizionamento della paura è più intensivo della maggior parte perché l'obiettivo di questi esperimenti è aumentare l'estinzione. Con un lieve condizionamento della paura che si estingue facilmente, un effetto pavimento può oscurare questo miglioramento.

1. Ospita gli animali con un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua. Maneggiare gli animali ogni giorno durante il recupero da un intervento chirurgico.
2. Installare l'apparecchio di condizionamento e collaudo, costituito da una scatola operativa alloggiata in una camera insonorizzata (Figura 1C). La scatola operativa ha pareti in plastica trasparente, 20 x 20 x 20 cm, e ha un pavimento a griglia in acciaio inossidabile, collegato a un generatore di scosse a pedale. Usa una luce bianca per illuminare la camera per la registrazione video. Utilizzare un tono di pressione sonora (SPL) di 9 kHz, 85 dB come stimolo condizionato (CS).
3. Registra il comportamento utilizzando una fotocamera digitale situata all'interno della camera sopra la scatola operativa. Visualizzare e monitorare la sessione su un computer situato all'esterno della sala comportamenti. Salva i video per un'analisi successiva.
4. Pulire le camere con etanolo al 70% prima e dopo ogni sessione per eliminare i segnali olfattivi.
5. Condizionare i ratti per 2 giorni (Figura 2A). Conferma che i ratti non hanno paura innata del tono presentando 5 toni (9 kHz, 85 dB, 30 s) il primo giorno. Assicurarsi che i livelli di congelamento siano trascurabili.
   1. Segui le presentazioni iniziali dei toni con 8 accoppiamenti tono-scossa (1 s, 0,5 mA) in ciascuno dei 2 giorni consecutivi. Ripeti di nuovo gli accoppiamenti tono-footshock il secondo giorno. Variare l'intervallo interstimolo (ISI) tra 2 e 4 minuti, con una media di 3 minuti per ogni prova. Randomizza il punto in cui si verifica lo shock durante il tono.
6. Il terzo giorno, metti alla prova la forza dell'associazione tono/shock. Suona 4 toni con un ISI di 3, 4 o 5 minuti (4 minuti in media) in assenza di scosse ai piedi e registra il comportamento di congelamento degli animali durante le presentazioni dei toni e durante gli intervalli interstimolo come misura della risposta di paura condizionata (CFR).
7. Il giorno 4, inizia l'allenamento per l'estinzione con la stimolazione del nervo vago (VNS) o VNS fittizio.
   1. Collega i ratti allo stimolatore inserendo i connettori maschili dallo stimolatore nel sito di input della stimolazione. Collocare gli animali nella camera (Figura 1A, 1C). Impostare lo stimolatore su 0,4 mA, larghezza dell'impulso di 500 μs a 30 Hz. Impostare la stimolazione su una durata totale di 30,15 s, a partire da 150 ms prima dell'inizio del tono. Riproduci animali 4 toni e abbina ogni presentazione di toni con VNS o VNS fittizio.
8. Testare periodicamente l'integrità elettrica del bracciale e del sito di input utilizzando un oscilloscopio.
   1. Collega l'animale come di consueto e dividi l'uscita dallo stimolatore all'oscilloscopio.
   2. Impostare l'intervallo sull'oscilloscopio da -20 V a +20 V ed eseguire la stimolazione. La forma d'onda della stimolazione a 30 Hz dovrebbe essere visibile sull'oscilloscopio. Stimolazioni di dimensioni superiori a 10 V indicano un'elevata impedenza e un funzionamento improprio del bracciale o della connessione nel sito di ingresso della stimolazione.
9. Per testare l'effetto della VNS sull'addestramento all'estinzione, eseguire un secondo test CFR il giorno 5. Registrare il tempo trascorso a congelare durante le presentazioni dei toni e confrontarlo con il congelamento di base registrato durante il primo test CFR.
10. Analizza i video utilizzando un osservatore indipendente che è cieco alle condizioni del trattamento. Misura il tempo trascorso a bloccarsi durante le presentazioni dei toni utilizzando un cronometro. Il congelamento è definito come una completa immobilità, durante la quale il ratto mostra una respirazione rapida, la testa abbassata e le zampe divaricate. L'analisi del comportamento di congelamento può essere suddivisa in due fasi: durante la presentazione del tono e durante l'intervallo interstimolo.

Risultati

Figura 1. Stimolazione del nervo vago e configurazione sperimentale. (A) Schema della configurazione utilizzata per VNS. Gli animali sono collegati a un'unità di isolamento della stimolazione tramite un cappuccio da cui 2 fili di platino-iridio conduco...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Betadine	Henry Schein	69066950
Fotocamera digitale - Webcam Logitech C210	Logitech	B003LVZO88
Filo di iridio al platino	Medwire	10IR9/49T
Stimolatore di impulsi isolato modello 2100	A-M	Codice: 720000
Sinometro Oscilloscopio a canale singolo da 10 MHz	Sinometro	CQ5010C
Extech 407730 Fonometro digitale da 40-130 decibel	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C a doppia uscita, shocker criptato	Kinder Scientific Co

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