Rigenerazione assonale nel nervo sciatico di un topo a seguito di una lesione da schiacciamento

Abstract

Fonte: Li, Q., et al. Indagine sulla rigenerazione degli assoni dei mammiferi: elettroporazione in vivo del ganglio della radice dorsale del topo adulto. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il processo di rigenerazione assonale in un nervo sciatico di topo a seguito di una lesione da schiacciamento. Il nervo isolato viene fissato e preparato per l'imaging, con proteine fluorescenti espresse nei neuroni per visualizzare la crescita degli assoni. Utilizzando un microscopio a epifluorescenza, la rigenerazione degli assoni viene tracciata dal sito della lesione per valutare l'entità della ricrescita.

Protocollo

1. Materiali e reagenti

1. Animali
   1. Usa topi CF1 femmina di sei settimane del peso di 30-35 g per gli esperimenti.
      NOTA: I topi sono stati alloggiati in gruppo (5 topi per gabbia) in gabbie sterilizzate ventilate individualmente con lettiera di pannocchie di mais da 1/4" e nidi quadrati da 2" per la nidificazione. Le gabbie sono state mantenute in un ciclo controllato di luce-buio di 12 ore e la temperatura ambiente era compresa tra 19,4 °C e 25 °C. I topi sono stati nutriti con una dieta globale per roditori e un sistema automatico di approvvigionamento idrico.
2. Strumenti
   1. Usa i seguenti strumenti chirurgici per condurre in modo efficiente l'intervento: siringhe monouso (27 G, 1.0 mL) per iniezione intraperitoneale, tagliapellicce, microscopio per dissezione stereoscopica, pinze per microchirurgia, forbici per microchirurgia, e piccoli rongeur ossei e spugne non tessute sterilizzate.
      NOTA: Tutti gli strumenti e i materiali sono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico o pre-sterilizzati dai produttori. Durante l'intervento chirurgico, gli strumenti vengono spruzzati con alcol al 75% per mantenere la sterilità.
3. Soluzioni anestetiche
   1. Usa la soluzione anestetica #1 per indurre l'anestesia e usa la soluzione anestesia #2 prima dell'iniezione dei gangli della radice dorsale (DRG) per mantenere l'anestesia.
      1. Per preparare la soluzione anestetica #1, diluire la ketamina e la xilazina in soluzione fisiologica sterile a una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1,2 mg/mL.
      2. Per preparare la soluzione anestetica #2, diluire l'avertina in soluzione fisiologica sterile a una concentrazione finale di 20 mg/mL.
4. Plasmidi di DNA e Oligo di RNA
   1. Prepara i plasmidi utilizzando il kit commerciale seguendo di conseguenza i protocolli del produttore. Diluire il DNA plasmidico in acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 2,0 μg/μL.
   2. Aggiungere la soluzione di colorante Fast Green per raggiungere una concentrazione finale di 0,005-0,01% (v/v) per una migliore visualizzazione del contorno DRG durante l'iniezione.
   3. Sciogliere i piccoli oligonucleotidi interferenti (siRNA) o microRNA (microRNA oligo) nei corrispondenti tamponi forniti dai produttori per raggiungere una concentrazione finale di 50 μM.
5. Pipetta per micro-iniezione
   1. Tirare il vetro capillare usando l'estrattore per micropipette e tagliare la punta della pipetta di vetro capillare tirata con le forbici per microchirurgia per generare un'apertura con un diametro esterno di circa 50 μm. Quindi, sterilizzare la pipetta di vetro sotto la luce UV su un banco pulito per circa 20-30 minuti.
   2. Montare la pipetta di vetro sterilizzata sul supporto della pipetta collegato a un sistema di erogazione di microiniezione intracellulare. Impostare i parametri del sistema di microiniezione a 30 psi di pressione e 8 ms di durata.
6. Sistema di elettroporazione
   1. Collega gli elettrodi al sistema di elettroporazione a onda quadra e imposta i seguenti parametri: 15 ms impulsi a 35 V con intervalli di 950 ms per l'elettroporazione in vivo.
7. Soluzione di perfusione e fissaggio
   1. Sciogliere la polvere di paraformaldeide (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione del 4% (p/v). Conservare la soluzione di PFA a 4 °C.

2. Procedure sperimentali

1. Esposizione chirurgica dei DRG L4 e L5
   1. Anestetizzare il topo utilizzando un'iniezione intraperitoneale della soluzione anestetica #1 preparata in precedenza (con ketamina 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina 12 mg/kg di peso corporeo).
   2. Radere l'area chirurgica con il tagliapellicce.
      NOTA: Poiché ci sarà un altro intervento chirurgico per lo schiacciamento del nervo sciatico sinistro, il pelo della coscia posteriore sinistra può essere rasato contemporaneamente.
   3. Posizionare il mouse sulla coperta riscaldata (35,0 °C) e monitorare la temperatura rettale con una sonda di temperatura.
   4. Per testare l'anestesia, pizzicare le dita dei piedi e la coda del topo e osservare le risposte comportamentali.
   5. Fissa i quattro arti del topo sulla bacheca.
   6. Pulire l'area chirurgica con una soluzione di iodoforo e quindi utilizzare alcol al 75% per rimuovere lo iodoforo prima di tagliare la pelle.
   7. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   8. Prima dell'incisione, segnare entrambi i lati delle creste iliache con un pennarello fine. Tracciare una linea che colleghi i due punti delle creste iliache per facilitare l'identificazione delle posizioni dei DRG L5.
   9. Praticare un'incisione di 3 cm lungo la linea mediana della parte bassa della schiena con le microforbici. Inoltre, staccare i muscoli paraspinosi, come il musculus multifidus e il musculus longissimus lumborum, dai processi spinosi L3 a S1 ed esporre le faccette articolari di L4-5 e L5-6.
   10. Utilizzare un micro-rongeur per rimuovere le faccette articolari di L4-5 e L5-6. Inoltre, rimuovere l'arco neurale sinistro di L4 e L5 per esporre il lato dorsale dei DRG.
2. Iniezione di DRG
   1. Inietta una soluzione anestetica #2 (con avertin 200 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale per mantenere l'anestesia prima dell'iniezione di DRG.
   2. Caricare i plasmidi di DNA o gli oligo di RNA (1 μL per DRG) nella pipetta capillare di vetro.
   3. Inserire con cautela la punta della pipetta capillare in vetro nel DRG.
   4. Iniettare gradualmente 1,0 μL di soluzione di plasmidi di DNA o oligo di RNA nel DRG utilizzando i sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare (30 psi, 8 ms).
      NOTA: La durata dell'iniezione non deve durare meno di 5 minuti.
3. Electroporation
   1. Rilascia PBS sulle punte degli elettrodi.
   2. Pulisci l'emorragia con una garza di cotone quadrata sterilizzata.
   3. Pizzicare delicatamente il DRG target con gli elettrodi e applicare 5 impulsi elettrici quadrati con il sistema di elettroporazione.
   4. Chiudere rispettivamente gli strati muscolari e cutanei con suture di nylon 5-0.
   5. Posizionare il topo su una coperta riscaldata (35,0 °C) con molta attenzione fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Riportare il topo nella gabbia di casa dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia.
      NOTA: Il topo impiega circa 60 minuti per riprendersi completamente dall'anestesia sulla coperta a 37 °C. Sciogliere una pillola (200 mg) di ibuprofene in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per l'alimentazione quotidiana per alleviare il dolore post-operatorio.
4. Schiacciamento del nervo sciatico
   Due
   1. o tre giorni (a seconda del disegno sperimentale) dopo l'elettroporazione DRG, anestetizzare il topo per via intraperitoneale con la soluzione anestetica #2 (con avetta 400 mg/kg di peso corporeo).
   2. Fissa i quattro arti del topo sulla bacheca.
   3. Praticare un'incisione di 1 cm, 0,5 cm sul lato sinistro lungo la linea mediana. Tagliare longitudinalmente i muscoli, come il muscolo grande gluteo e il muscolo piriforme. Esporre il segmento del nervo sciatico tra il grande forame sciatico e l'incisura sciatica.
   4. Schiacciare il nervo con una pinza per microchirurgia per 12 s e contrassegnare il sito di schiacciamento con una sutura epineurale in nylon 10-0. Fai un nodo sulla membrana durale per segnare il sito di schiacciamento.
   5. Chiudere gli strati muscolari e cutanei con sutura di nylon 5-0.
   6. Posizionare il topo su una coperta riscaldata (35,0 °C) con molta attenzione fino a quando non ha completamente riacquistato conoscenza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Rimetti il topo nella gabbia di casa dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia.
      NOTA: Ci vogliono circa 60 minuti perché il topo si riprenda completamente dall'anestesia sulla coperta a 37 °C. Sciogliere una pillola (200 mg) di ibuprofene in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per l'alimentazione quotidiana per alleviare il dolore post-operatorio.
5. Perfusione del topo, DRG e raccolta del nervo sciatico
   Due
   1. o tre giorni dopo lo schiacciamento del nervo sciatico (a seconda del disegno sperimentale), anestetizzare il topo per via intraperitoneale con la soluzione anestetica #2.
   2. Perfondere il topo per via transcardiaca con PBS (pH 7,4) seguito da paraformaldeide (PFA) al 4% ghiacciata (pH 7,5) in PBS.
   3. Dopo la perfusione, separare accuratamente i DRG insieme alle radici nervose e al nervo sciatico prima del ginocchio con micro-forbici e micro-pinze al microscopio da dissezione. Posizionare il nervo sciatico direttamente in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
6. Imaging e misurazione degli assoni sensoriali marcati con fluorescenza
   1. Strappare il tessuto attaccato e la membrana sul nervo sciatico fisso con micro-forbici e micro-pinze con attenzione sotto il microscopio di dissezione. Quindi, sostituisci il 4% di PFA con PBS e lava il nervo tre volte.
   2. Posiziona il nervo sciatico su un vetrino e tienilo dritto. Aggiungere 80 μl di soluzione antisbiadimento attorno al nervo, quindi stendere un vetrino coprioggetti su di esso. Appiattire l'intero tessuto montato con la pressione.
   3. Posizionare i tessuti appiattiti sul microscopio a epifluorescenza invertita dotato di un accessorio per l'acquisizione del mosaico e l'elaborazione delle immagini.
      NOTA: Le lunghezze di eccitazione ed emissione sono di 488 nm e 509 nm. È anche possibile acquisire manualmente più immagini sovrapposte e unire le immagini utilizzando ImageJ con il plug-in Mosaic.
   4. Quando si misura la lunghezza degli assoni rigenerati, tracciare tutti gli assoni identificabili marcati in fluorescenza nel nervo sciatico dal sito di schiacciamento (contrassegnato con la sutura epineurale 10-0) alle estremità degli assoni distali.

Materiali