Somministrazione mirata di farmaci in un modello murino tramite iniezione di Cisterna Magna

Abstract

Fonte: Zamboni, M., et al., Induzione della modifica delle cellule leptomeningee tramite iniezione intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la procedura di somministrazione di un farmaco induttore nella cisterna magna di un topo anestetizzato. L'iniezione induce selettivamente l'espressione di marcatori fluorescenti nelle cellule della superficie cerebrale accessibili tramite il liquido cerebrospinale, confermata dall'imaging a fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Posizionamento dell'animale per la procedura

1. Fissare la testa dell'animale sul supporto della testa. Per migliorare l'accessibilità alla cisterna magna, posizionare il corpo dell'animale a circa 30° dalla superficie del tavolo e la testa inclinata verso il basso, in modo da stabilire un angolo di 120° con il resto del corpo ed estendere la parte posteriore del collo per facilitare l'accesso alla cisterna magna (Figura 1A).
2. Aggiungi tovaglioli di carta sotto l'animale per sostenere il suo corpo durante tutta la procedura.
3. Assicurare l'erogazione dell'anestesia attraverso il boccaglio e ridurre la concentrazione di isoflurano al 2,5% e l'erogazione dell'aria a 200 ml/min.
4. Applicare un unguento oftalmico.

2. Esposizione della Cisterna Magna

1. Radere la parte posteriore del collo dell'animale e sanificare l'area con etanolo al 70% e Betadina.
2. Con le forbici chirurgiche, eseguire un'incisione sulla linea mediana (circa 7 mm di lunghezza) partendo dal livello dell'osso occipitale ed estendendola posteriormente.
3. Separa delicatamente il tessuto connettivo superficiale e i muscoli del collo, tirando lateralmente dalla linea mediana con una pinzetta a punta fine. Questo esporrà la membrana durale che si sovrappone alla cisterna magna, a forma di triangolo rovesciato.
4. Utilizzare lance di assorbimento sterili o tamponi di cotone per controllare l'eventuale sanguinamento risultante.
5. Posizionare un piccolo separatore chirurgico per mantenere i muscoli del collo tirati da parte e consentire la visualizzazione della cisterna magna durante tutta la procedura.

3. Iniezione intracisternale

1. Per accedere alla cisterna magna, identificare l'estremità caudale dell'osso occipitale e inserire l'ago che è stato precedentemente piegato immediatamente sotto.
   NOTA: Ci sarà un improvviso calo di resistenza quando la membrana durale viene perforata. Tuttavia, la punta dell'ago penetrerà solo leggermente sotto la superficie meningea, grazie alla sua forma uncinata.
2. Una volta perforata la dura madre, lasciare che la punta piegata dell'ago penetri sotto la superficie durale tirando delicatamente la siringa verso l'alto e parallelamente al corpo dell'animale, in modo da "agganciare" l'ago al cranio (vedi Figura 1B). Questo garantirà una migliore stabilità e impedirà all'ago di penetrare più in profondità, evitando così il rischio di danneggiare il cervelletto o il midollo sottostante.
3. Iniettare il composto lentamente per evitare interferenze con il flusso naturale del liquido cerebrospinale.
   NOTA: A seconda dello scopo dell'esperimento, la velocità di infusione può variare. Se è richiesta una velocità di infusione lenta e costante (ad esempio, quando si utilizza la procedura per tracciare il movimento del liquido cerebrospinale), può essere consigliabile utilizzare un sistema di microinfusione automatizzato in combinazione con la siringa.
4. Dopo l'iniezione, lasciare riposare l'ago nel sito per 1 minuto e rimuoverlo con cura. Utilizzare una pinza a punta fine per facilitare la retrazione dell'ago dalla sua posizione uncinata.
   NOTA: L'uso di un ago sottile (ad es. 30 G) non comporta danni sostanziali alla membrana meningea e conseguente deflusso del liquido cerebrospinale. Se sono necessarie aghie di dimensioni maggiori, si consiglia di arrestare la fuoriuscita di liquido applicando pressione nel sito di iniezione utilizzando una punta di cotone sterile.

Risultati

Figura 1: Etichettatura specifica delle cellule leptomeningee tramite iniezione intracisternale di endoxifen. I pannelli A e B illustrano la procedura sviluppata per la somministrazione intracisternale. Per ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Unità di anestesia	Univentor 410	8323102	Completo di vaporizzatore, camera e tubo che si collega alla camera e al supporto della testa del mouse
Anestesia (Isoflurano)	Baxter Medical AB	890
Betadine	Sigma-Aldrich	PVP1
Endoxifen	Sigma-Aldrich	E8284
Etanolo 70%	Histolab	1370
Siringa Hamilton (ago smussato 30G)	Hamilton	80300
Supporto per testa di mouse	Narishige International	SGM-4	Con boccaglio per anestesi inalatori. In alternativa, utilizzare un telaio stereotassico
Forbici	Strumenti per la scienza fine	15009-08
Rasoio	Aesculap	GT420
Lance ad assorbimento sterili Strumenti per	scienza fine	18105-01	Anche i tamponi di cotone sterili sono una buona opzione
Separatore chirurgico	Strumento di precisione mondiale	501897
Pinzette	Dumont	11251-35

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