Trapianto stereotassico di sospensione di cellule neurali in un topo con lesione cerebrale traumatica

Abstract

Fonte: Furmanski, O., et al. Modello di impatto corticale controllato di lesione cerebrale di topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, le cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo vengono iniettate stereotassicamente nel confine tra materia grigia e materia bianca della corteccia profonda in un modello murino di lesione cerebrale traumatica. Le cellule trapiantate si integrano nel tessuto, favorendo il recupero funzionale e la riparazione dei circuiti nel cervello danneggiato.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trapianto stereotassico di sospensione cellulare

1. Iniziare la procedura di trapianto cellulare circa 24 ore dopo la craniectomia.
2. Preparare l'attrezzatura per il trapianto di cellule e le forniture chirurgiche
   1. Riempire una siringa slip-tip da 1 ml con soluzione fisiologica sterile per l'irrigazione delle ferite. Collegare un ago da 25 G alla siringa per controllare l'irrigazione.
   2. Riempire una siringa slip-tip da 1 ml con una soluzione di CsA (ciclosporina A) per l'immunosoppressione. Collegare un ago da 25 G o più grande alla siringa CsA. Riempire la siringa CsA secondo necessità tra un intervento chirurgico e l'altro.
   3. Preparare aghi di vetro da pipette capillari in vetro borosilicato con diametro esterno di 1,0 mm utilizzando metodi standard.
   4. Utilizzare una pinzetta sottile per rompere le punte dell'ago a un diametro di circa 200 μm. Assicurarsi che l'asta cilindrica dell'ago non sia più lunga di 2,5 cm.
3. Calibrare la pompa a siringa per l'uso con una siringa da 10 μl. Inserire una velocità di flusso di 0,2 μl/min per erogare un volume totale di 2,0 μl.
4. Preparare la sospensione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).
   1. Esegui tutta la manipolazione delle cellule in una cappa per colture cellulari BSL-2 (Biosicurezza livello 2) utilizzando tecniche di manipolazione sterili standard.
   2. Preparare le colture cellulari in anticipo secondo le condizioni standard definite per il tipo di cellula.
      NOTA: Gli esperimenti mostrati in questa dimostrazione hanno utilizzato varie cellule del fenotipo neurale derivate dalle hiPSC.
   3. Dissociare delicatamente le cellule in una sospensione a cellula singola utilizzando una soluzione di distacco cellulare o altri mezzi enzimatici o chimici preferiti.
   4. Contare le cellule in sospensione, quindi diluire la sospensione a 5 x 10⁴ cellule/μL in un terreno di coltura cellulare minimo (ad es. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) in una provetta flip top da 1,7 mL.
   5. Osservare le seguenti note per il trapianto:
      1. Mantenere le cellule in sospensione a 37 °C per la durata delle procedure.
      2. Caricare la siringa solo immediatamente prima di eseguire l'iniezione intraparenchimale
         NOTA: Se la sospensione cellulare viene adagiata su un lato, la gravità può farla depositare o aderire al lato della siringa, causando irregolarità nel numero di cellule iniettate.
      3. Assegnare ~5 x 10⁵ cellule (10 μL di sospensione) per topo se si eseguono più procedure di trapianto di cellule in un giorno.
5. Esegui un intervento chirurgico di trapianto stereotassico
   1. Posiziona il topo in una camera di induzione dell'anestesia collegata a un vaporizzatore di isoflurano con una fonte di ossigeno compresso. Indurre l'anestesia con isoflurano ~3% a ~0,7 L/min di ossigeno.
   2. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica con un cono anestetico attaccato.
      1. Fissa la testa in posizione con barre auricolari e una barra per morsi, orientando la testa in modo che l'osso frontale del cranio sia orizzontale. Mantenere l'anestesia all'1,5%-2% di isoflurano per tutta la durata dell'intervento.
   3. Eseguire la cura preoperatoria e la preparazione asettica
      1. Applicare un unguento oftalmico idratante contenente antibiotici sugli occhi utilizzando un batuffolo di cotone.
      2. Lavare il sito dell'incisione con soluzione fisiologica sterile per pulire il sito e allentare le suture. Applicare delicatamente etanolo al 70% con un batuffolo di cotone per sterilizzare il sito di incisione.
   4. Rimuovere i punti di sutura utilizzando una pinzetta sottile e forbici oftalmiche. Irrigare il sito chirurgico e la craniectomia con abbondante soluzione fisiologica sterile.
      1. Se la corteccia mostra caratteristiche squalificanti, come ernia eccessiva, scolorimento, vascolarizzazione interrotta o emorragia, l'animale dovrebbe essere escluso.
   5. Caricare la siringa per il trapianto di cellule
      1. Spostare la sospensione cellulare dall'incubatore a 37 °C a una cappa di biosicurezza per colture cellulari. Agitare delicatamente o picchiettare la provetta per garantire una sospensione cellulare omogenea.
      2. Utilizzare un micropipettatore per caricare una sospensione cellulare da ~7,5 μL nella siringa Hamilton attraverso l'estremità dello stantuffo.
         1. Tieni la siringa a un angolo di ~120° con l'estremità dello stantuffo rivolta verso il basso. Inserire lo stantuffo, facendo attenzione a non introdurre una bolla d'aria tra la sospensione e la punta dello stantuffo.
      3. Collegare il gruppo guarnizione all'ago della pipetta, quindi collegare l'ago alla siringa.
      4. Spingere lo stantuffo per spostare la sospensione cellulare nell'ago della pipetta. Se c'è resistenza contro il deflusso della sospensione, utilizzare una pinzetta sottile per rompere la punta dell'ago per ingrandire il diametro.
   6. Collegare la siringa alla pompa a siringa stereotassica. Far avanzare lo stantuffo per assicurarsi che il gruppo della pompa a siringa funzioni correttamente.
   7. Spostare l'ago nelle coordinate per l'iniezione.
      1. Allinea la punta dell'ago a bregma. Imposta le coordinate X e Y su 0. Quindi spostare la punta dell'ago sopra la craniectomia a 2,0 mm lateralmente e -1,0 mm posteriormente alla bregma. Toccare la punta dell'ago sulla superficie della dura madre e impostare la coordinata stereotassica su Z = 0.
      2. Spingere lo stantuffo per assicurarsi che la sospensione cellulare scorra adeguatamente prima di introdurre l'ago nel cervello.
      3. Introdurre l'ago nel cervello a una profondità di Z = -1,4 mm. Queste coordinate stereotassiche collocano l'innesto al confine tra materia grigia e materia bianca della corteccia profonda.
   8. Avviare la pompa a siringa per infondere la sospensione cellulare. Impostare il timer del banco di laboratorio su 15 minuti e avviare il timer. Utilizzare un microscopio a lunga distanza di lavoro per monitorare il deflusso delle sospensioni cellulari.
      1. Irrigare il sito dell'intervento chirurgico con soluzione fisiologica sterile durante l'iniezione per mantenere l'idratazione dei tessuti.
      2. A 15 minuti, estrarre lentamente l'ago da trapianto. Irrigare il sito dell'intervento con soluzione fisiologica e chiudere l'incisione con punti di sutura.
   9. Esegui l'assistenza postoperatoria
      1. Interrompere l'anestesia. Somministrare CsA per iniezione sottocutanea nella collottola alla dose di 10 mg/kg. Metti il mouse in una gabbia postoperatoria pulita e preriscaldata.
      2. Fornire analgesico paracetamolo nell'acqua potabile a 1,0 mg/mL.
         NOTA: Fornire analgesia secondo il protocollo operativo standard (SOP) dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) appropriato e in considerazione delle variabili di esito sperimentale.
      3. Fornire una gabbia di recupero del cibo inumidita per favorire la reidratazione e il recupero.
6. Continuare le iniezioni giornaliere di CsA a 10 mg/kg per tutta la durata della sopravvivenza del topo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 ml siringhe	Becton Dickinson (BD)	309659
1.7 ml flip top provette	Denville	C2170
10 microlitri siringa	Hamilton	7635-01
25G Aghi per siringa Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70% Etanolo			Prodotto a scelta; varia in base alla regione
Paracetamolo sospensione orale	Tylenol (Children's)		Diluire a 1 mg/ml in acqua
Vaporizzatore anestetico	Vetland	0521-11-22
Panno		per la manipolazione degli animali	Acquisto dai grandi magazzini
Betadine	Purdue Prodotti	NDC-67618-151-32
Ossigeno			Prodotto a scelta; varia in base alla regione
Ciclosporina A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Nastro isolante	3M Corporation		Acquisto dai grandi magazzini
Pinzette fini	Strumenti per la scienza	11254-20
Pinze	Strumenti per la scienza fine	91106-12
Pipette capillari in vetro, diametro esterno 1 mm, ID 0,58 mm	World Precision Instruments	1B100F-3
Kit micromotore rotativo ad alta velocità	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Burr Set Di 5	Cell Point Scientific	60-1000
Impact One Stereotassico Impactor per CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Timer da banco	Fisher Scientific	14-649-17
Micropipetta estrattore	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Qualsiasi estrattore sarà sufficiente
Vetrini coprimicroscopio	Fisherbrand	12-545-E
		vetrini per microscopio	Prodotto a scelta
Specchio			Acquisto dai grandi magazzini
Portaaghi emostatico	Fine Science Tools	12002-12
Oftalmico unguento	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Forbici a molla oftalmiche	Fine Science Tools	15018-10
Scatola			Acquisto da un grande magazzino
Cilindro			Acquisto da un grande magazzino
Pompa a siringa motorizzata QSI	Stoelting	53311
Raccordo a compressione con ago rimovibile	Hamilton	55750-01
Piccolo telaio stereotassico per roditori	Stoelting	51925
Forbici piccole	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol	Fisherbrand	06-669-62
Tamponi di cotone sterili/Kendall Q-tips	Tyco Healthcare	540500
Soluzione salina sterile	Hospira	NDC-0409-1966-07
Cronometri (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold vetrini per microscopio	Fisherbrand	15-188-48
Suture - seta 5.0 con ago curvo	Oasi	MV-682

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