Trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali per la regolazione epigenetica dell'espressione dell'alfa-sinucleina

Abstract

Fonte: Tagliafierro, L., et al. Piattaforma vettoriale lentivirale per la somministrazione efficiente di strumenti di editing dell'epigenoma in modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali (NPC) per la modifica epigenetica mirata dell'alfa-sinucleina, una proteina chiave nella malattia di Parkinson. Il protocollo consente la metilazione del DNA mediata dalla metiltransferasi, riducendo l'espressione di SNCA per lo studio della regolazione genica e dei potenziali interventi terapeutici.

Protocollo

1. Differenziazione delle cellule progenitrici neurali dopaminergiche

1. Scongelamento delle NPC MD (cellule progenitrici neurali dopaminergiche del mesencefalo)
   1. Preparare una piastra rivestita di BMM (membrana della matrice di base) e riscaldare N2B27 completo. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 caldo a una provetta conica da 15 mL. Metti un crioviale in un blocco termico a 37 °C per 2 min.
      1. Trasferisci le cellule dal crioviale alla provetta contenente DMEM/F12. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
      2. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in 2 mL di N2B27 e aggiungere la sospensione cellulare a un pozzetto della piastra rivestita di BMM. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5%.

2. Trasduzione delle NPC MD e analisi delle variazioni di metilazione

1. Trasduzione delle NPC MD
   1. Trasduzione delle NPC MD alla confluenza del 70% con i vettori guida LV (vettore lentivirale)/Cas9-DNMT3A (DNA metiltransferasi enzimatica 3A) disattivati a MOI (molteplicità dell'infezione) = 2. Sostituire il mezzo N2B27 16 ore dopo la trasduzione.
   2. Aggiungere N2B27 con 5 μg/mL di puromicina, 48 ore dopo la trasduzione. Coltura delle cellule per 3 settimane in N2B27 più puromicina per ottenere le linee NPC MD stabili. Le cellule sono pronte per le applicazioni a valle (DNA, RNA, analisi delle proteine, caratterizzazione fenotipica, congelamento e passaging).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Equipment
15mL provette da centrifuga coniche	Corning	430791
piastre a 6 pozzetti	Corning	3516
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Microscopio a fluorescenza invertita	Leica	DM IRB2
Reagenti
Soluzione antibiotico-antimicotica, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Integratore (50X), meno vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC Qualified Matrix	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

per colture cellulari