Trasduzione virale in utero in un topo

Abstract

Fonte: Lutz, D., et al. Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturale dopo la trasduzione in utero del cervello di topo in via di sviluppo e del midollo spinale. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra la trasduzione virale tramite iniezione in utero in embrioni di topo. Una topolina incinta viene preparata per l'intervento chirurgico e viene praticata un'incisione sulla linea mediana per esporre le corna uterine. Una miscela di un virus contenente il gene desiderato e un colorante tracciante viene iniettata negli embrioni all'interno delle sacche uterine nelle posizioni mirate. Le corna uterine vengono quindi riposizionate prima della sutura.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trasduzione in utero

:

1. preparare il virus adeno-associato di tipo 1 (AAV1) che codifica per il bersaglio desiderato (4 x 10,¹¹ particelle virali/μL di AAV1) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a pH 7,4. Aggiungere 0,1 mg/μL di Fast Green e mantenere la miscela AAV1-Fast-Green a 37 °C.
2. Preparare una punta capillare sottile con la forma desiderata (8 mm di lunghezza, con un diametro esterno di 80 μm e un diametro interno di 50 μm) utilizzando un estrattore per micropipette (impostazioni: pressione = 500, calore = 700, trazione = 0, velocità = 80, tempo = 200, vedere la Tabella dei materiali). Rompere la punta del capillare in modo che sia di 4-5 mm.
3. Assemblare una provetta aspiratore (44 cm x 0,7 cm) con la punta capillare e aspirare 15 μl della miscela AAV1-Fast-Green nel capillare.
4. Mantenere i soggetti animali a una temperatura corporea fisiologica costante di 37 °C durante l'intera procedura.
5. Posizionare un topo C57Bl/6 gravido (giorno embrionale 14,5) nella camera di preincubazione e anestetizzare il topo con isoflurano gassoso al 4% (con una portata d'aria volumetrica di 0,6-0,8 L/min).
6. Per via sottocutanea, iniettare buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo).
7. Posizionare il topo anestetizzato sulla placca chirurgica preriscaldata (37 °C).
8. Coprire gli occhi con un lubrificante.
9. Montare sul topo la maschera per anestesia (isoflurano gassoso all'1,5% a una portata d'aria volumetrica di 0,6-0,8 L/min) sulla placca chirurgica e radere la regione cutanea addominale. Pulire la regione rasata con 3 volte etanolo al 75% e poi con una soluzione di betadine.
   NOTA: Monitorare continuamente il comportamento respiratorio del topo anestetizzato. Regolare la concentrazione del gas isoflurano in base al modello di inalazione-espirazione del topo.
10. Verificare l'assenza del riflesso plantare stringendo le falangi delle zampe posteriori del topo.
11. Aprire la cavità addominale afferrando la pelle con una pinza a iride seghettata curva (10 cm) e tagliando la pelle lungo la linea mediana con forbici diritte in carburo di tungsteno (10 cm), e poi, afferrando la parete peritoneale con una pinzetta Dumont diritta (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) e tagliando la parete lungo la linea alba con le forbici diritte di Vanna (8 cm).
12. Posizionare un pezzo di pellicola di paraffina fenestrata sull'apertura addominale e fissare la pellicola su entrambe le estremità con una pinza emostatica per microzanzare (12,5 cm, curva).
13. Esporre le corna uterine con un dispositivo simile a un cucchiaio per evitare danni agli embrioni all'interno delle corna uterine. Far gocciolare alcune gocce di PBS (37 °C) sulle corna uterine e ispezionare gli embrioni per verificare la presenza di danni o malformazioni all'interno del sacco uterino.
14. Documentare l'ordine e la posizione degli embrioni nelle corna uterine. Girare con cura gli embrioni all'interno del sacco uterino fino a raggiungere la posizione desiderata per l'iniezione.
15. Iniettare 1-2 μl della miscela AAV1-Fast-Green ispezionando visivamente il sito di iniezione (ad es. ventricoli cerebrali) e la penetrazione del colorante allo stereomicroscopio.
16. Documentare gli embrioni iniettati e riposizionare le corna uterine con gli embrioni iniettati nella cavità addominale.
17. Far gocciolare alcune gocce di PBS (37 °C) nella cavità addominale. Chiudere la cavità suturando la parete peritoneale (utilizzare suture in poliammide 6-0) e la pelle (utilizzare suture in poliammide 3-0) utilizzando la pinza emostatica per zanzare di Halsted (12,5 cm, curva). In alternativa, utilizzare un semplice modello interrotto o suture/graffette in acciaio inossidabile per chiudere la cavità addominale e la pelle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
26Gx 1'' ago	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Unità di anestesia per pompa ad aria	Strumenti biomedici (Univentor)	8323102
Sierotipo 1 del virus adeno-associato (AAV1)	UKE (Virale Core Facility)	-	Per riferimenti e aree target di AAV1 vedere: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ e anche: Designer gene delivery vectors: ingegneria molecolare ed evoluzione di vettori virali adeno-associati per un migliore trasferimento genico. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 marzo; 25(3):489-99. I vettori virali AAV ricombinanti pseudotipizzati con capsidi virali dei sierotipi 1, 2 e 5 mostrano efficienza differenziale e tropismo cellulare dopo la consegna in diverse regioni del sistema nervoso centrale. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. agosto 2004; 10(2):302-17. I vettori di virus adeno-associati ricombinanti auto-complementari (scAAV) promuovono una trasduzione efficiente indipendentemente dalla sintesi del DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto 2001; 8(16):1248-54.
pompe d'aria	(Univentor)	Eheim 100
	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Maschera respiratoria Alluminio anodizzato per topo	Strumenti biomedici (Univentor)	-
Buprenorfina	Fiale temgesiche		antidolorifici
Capillari	Scienza-Prodotti	GB100TF-10	con
pinzetta Dumont con riempimento (#3, 12 cm, dritta, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Rasoio elettrico	Phillips-Suture
Ethicon (Ethilon, 6-0 e 3-0)	Ethicon-poliammide
Lubrificante oculare	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	per la visualizzazione dei liquidi iniettati Interruttore di
instradamento del gas 4/2 connettori	Strumenti biomedici (Univentor)	8433020
Pinza emostatica Halsted Mosquito (12,5 cm, diritta)	FST	13011-12
Scatola di induzione per topi con coperchio mobile orizzontalmente.Dimensioni interne: LxBxH: 155x115x130 mm.Spessore della parete: 6 mm	Strumenti biomedici (Univentor)	-
Pinze per iride (10cm, curve, seghettate)	FST	14007-14
Forbici per iride (11cm, diritte, carburo di tungsteno)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, riscaldate elettricamente, smDimensioni esterne: 257x110x18 mm.Area di riscaldamento: 190x90 mmLa rimozione dell'isoflurano che fuoriesce dalla maschera respiratoria avviene verso il basso nel rispetto delle normative	Strumenti biomedici (Univentor)	-
Isoflurano (Attane)	JD anestesia medica		inalazione
Microscopio ottico Basic DM E	Leica-4x		(N.A. 0,1 ∞/-), 10x (N.A. 0,22 ∞/0,17), 40x (N.A. 0,65 ∞/0,17), 100x (N.A. 1,25 ∞/0,17) obiettivi
	Science-Products	P-97
Pinze emostatiche per zanzare (12,5 cm, curve)	FST	13010-12
Termoestrattore P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Materiale del tubo per il collegamento di tutte le partiDiametro esterno: 6 mmDiametro interno: 4 mmSpessore della parete: 1 mm	Biomedical Instruments (Univentor)
Forbici Vannas (8 cm, dritte)	FST	15009-08

Strumenti biomedici per Gruppi di sintonizzazione per aspiratori per