Iniezione stereotassica di idrogel in un modello murino post-ictus

Abstract

Fonte: Wilson, K.L., et al. Iniezione di scaffold di biomateriali in idrogel al cervello dopo l'ictus. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un idrogel nel nucleo dell'ictus di un topo post-ictus, evidenziando il suo ruolo nella formazione di scaffold che imita la matrice extracellulare, promuove l'infiltrazione cellulare e supporta l'angiogenesi, sottolineando il suo potenziale neuroterapico nel recupero dall'ictus.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Iniezione di idrogel o altri biomateriali

1. Eseguire l'iniezione di biomateriali in un momento definito dall'utente. In questo esperimento, le iniezioni sono state eseguite tra 5 e 7 giorni dopo l'ictus. Vengono iniettati 2 - 6 μL di idrogel.
   1. Attiva il termoforo per mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'anestesia (37 °C).
   2. Preparare forbici autoclavate, pinze, cotone, unguento per gli occhi veterinario, colla chirurgica o materiale di sutura, alcol sterile e salviette di iodio beta. Preparare la fresa per ossa con testine sterili e le siringhe Hamilton in vetro da 25 μl con aghi in metallo da 30 G.
   3. Attivare la sterilizzazione a microsfere a 160 °C per consentire la sterilizzazione degli strumenti tra i topi.
   4. Collegare le pompe di iniezione al dispositivo stereotassico. Impostare la portata su 1 μl/min e impostare il volume su 4 μl.
   5. Prepara una gabbia pulita per i topi dopo l'intervento chirurgico.
2. Posizionare il topo nella camera di induzione con una concentrazione di isoflurano del 4% per anestetizzarlo fino a quando il movimento spontaneo si ferma e la sua respirazione raggiunge un ritmo lento e costante.
   1. Una volta addormentato, trasferisci e fissa il mouse sul dispositivo stereotassico con una concentrazione di isoflurano di mantenimento dell'1,5%.
   2. Applicare l'unguento per gli occhi del veterinario su entrambi gli occhi.
   3. Radi il pelo che potrebbe essere ricresciuto dalla testa del topo e prepara asetticamente l'area usando una salvietta imbevuta di alcol seguita da una salvietta di iodio beta. Ripetere tre volte.
      NOTA: Se necessario, utilizzare una salvietta imbevuta di alcol extra alla fine per rimuovere tutto lo iodio beta, poiché provoca irritazione della pelle e porta i topi a prudere il cranio dopo l'intervento chirurgico.
3. Usando le piccole forbici e/o pinze, riaprire la pelle sopra il cervello. Utilizzare cotone con soluzione fisiologica sterile o PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) per pulire eventuali detriti dal cranio. Saranno visibili un cerchio bianco-giallo (la corsa, Figura 1B) e il foro di bava del trapano. Se il tessuto morto non è visibile, probabilmente non si è verificato alcun ictus. Se il foro della bava non è centrato sopra la corsa, forare nuovamente per centrarlo.
4. Orientare la pompa di iniezione sopra il mouse e bloccarla a 90°. Pulire la siringa con soluzione fisiologica sterile o PBS prima di ricaricare il materiale.
   Una
   1. volta pulita, smonta la siringa di vetro in modo che non ci sia ago. Ricaricare la siringa utilizzando una pipetta a spostamento positivo da 25 μl con 10 μl di idrogel (o altro biomateriale qui con o senza cellule).
   2. Usando lo stantuffo della siringa, spingere il gel fino in fondo verso la parte anteriore della siringa. Quindi, rimontare la siringa e continuare a spingere fino a quando il gel non fuoriesce visibilmente dall'ago.
5. Posizionare la siringa sulla pompa. Potrebbe essere necessario regolare la parte posteriore della pompa in modo che la siringa si adatti. Regolare la portata a 30 μl/min, selezionare Prelievo o Iniezione a seconda della direzione in cui deve muoversi, quindi premere Start. Premere Stop quando la parte posteriore della pompa si trova nella posizione corretta.
   1. Avvita la parte posteriore della pompa in modo che la siringa sia sicura. Se in precedenza sono state effettuate regolazioni, assicurarsi che la portata sia impostata su 1 μL/min e sia impostata per l'iniezione.
6. Spostare la pompa nelle direzioni x e y per orientarla sul foro. Spostare la pompa verso il basso nella direzione z finché l'ago della siringa non tocca la parte superiore del foro.
7. Reimpostare la Z sulla console del display digitale. Quindi, spostare la siringa verso il basso nella direzione z di 0,750 mm. Se la siringa si piega o c'è resistenza, il cranio è guarito o non è stato completamente perforato e deve essere riforato.
8. Premere Start sulla console della pompa per iniettare 4 - 6 μl di idrogel a una velocità di 1 μl/min.
9. Impostare un timer di 5 minuti quando la pompa smette di iniettare per consentire al gel di iniziare la reticolazione.
10. Dopo 5 minuti, tirare lentamente verso l'alto la siringa ruotando lo z-nob. Guarda per vedere se del materiale viene accidentalmente tirato o fuoriesce dal foro. Sbloccare la pompa e allontanarla dal mouse quando l'ago è abbastanza lontano dal cranio.
11. Usando pinze, colla chirurgica o punti di sutura, chiudi la pelle sopra la testa. Metti il mouse nella gabbia pulita e osserva il suo recupero. Dovrebbero essere necessari circa 5-10 minuti prima che il topo si riprenda dall'anestesia.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica di bregma e localizzazione del tratto. (A) I lobi parietali si incontrano in alto per formare il bregma. Il posizionamento del laser è stato centrato 2,0 mm a sinistra del bregma. (

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
25uL Hamilton Syringe 702RN, senza ago	Fishcer Scientific	14824663	Siringhe utilizzate per iniettare biomateriali
25uL Pipetta a spostamento positivo	Gilson	M-25
Piattaforma da palco regolabile	Kopf Strumenti	901
C57BL/6 Topi	Jackson Laboratory	664	8-12 settimane di età
Assemblaggio gabbia Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Lungo, diametro 6 mm, confezione da 4 - per il fissaggio del laser allo sterotax
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 puntali per pipette	Gilson	F148012
Piastra riscaldante	Kopf Strumenti	HP-4M
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Miltex Adson Dressing Pinze, grado dissetante	Intefra Miltex	V96-118
Mini-pompa a portata variabile	Thomas Scientific	70730-064	Pompa per perfusioni
Supporto per testa per anestesia a gas di topo	Kopf Instruments	923-B
Scatola di controllo Nanojet	Chemyx	10050
Connettore per pompa Nanojet	Chemxy	10051	Collegare al dispositivo stereotassico per l'iniezione di biomateriale
Ago RN 30G PT STY 3, 0,5 pollici	Fishcer Scientific	NC9459562
Barre auricolari non rotture 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Unguento	Dr. Foster Smith	9N-76855
Sonda rettale Topo	Kopf Instruments Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Siringa per insulina con marcature da 1/2 unità 0,5 mL	VWR	10002-726	Per iniettare il rosa bengala
StainTray Sistema di colorazione per vetrini	Simport Scientific	M920-2	Per la colorazione dei vetrini
Dispositivo sterotassico	Kopf Instruments	940	Strumento stereotassico per piccoli animali
Pinza Adson per studenti -1x2 denti Strumenti per	scienze fini	91127-12
Pinze per studenti - gambi dritti/larghi Strumenti per le	scienze fini	91113-10
Regolatore di temperatura	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Composto Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931

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