Trattamento dei tumori cerebrali in un modello murino mediante terapia sonodinamica

Abstract

Fonte: Mess, G., et al. Terapia sonodinamica per il trattamento del glioblastoma multiforme in un modello murino utilizzando un sistema a ultrasuoni focalizzato portatile da banco. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra un protocollo per l'esecuzione della terapia sonodinamica su un tumore cerebrale in un modello murino utilizzando gli ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica (MRgFUS). Prima del trattamento viene somministrato un precursore sonosensibilizzante, che si accumula nelle cellule tumorali e viene attivato dagli ultrasuoni focalizzati per produrre specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questi ROS inducono stress ossidativo, con conseguente morte delle cellule tumorali e riduzione della proliferazione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Procedure di risonanza magnetica (MRI)

1. Prendere il lettino per risonanza magnetica con l'animale fissato stereotassicamente e posizionarlo nella culla per risonanza magnetica precedentemente collegata allo scanner per risonanza magnetica (vedi Tabella dei materiali), inserendo il foro del letto per risonanza magnetica alla sua estremità con il piolo sulla culla per risonanza magnetica, come mostrato nella Figura 1. Collegare i tubi per anestesia di ingresso e di uscita ai tubi corrispondenti nella macchina per la risonanza magnetica.

2. Far scorrere la culla per risonanza magnetica contenente l'animale nel foro della risonanza magnetica, assicurandosi di mantenere la stessa posizione in cui è stato posizionato il fantasma.

3. Eseguire un localizzatore per vedere la posizione del cervello dell'animale e quindi una risonanza magnetica ponderata in T1 post-contrasto che copre l'intero cervello.

4. Esportare la scansione MRI come un insieme di file DICOM non compressi, uno per ogni sezione.

2. Trattamento con ultrasuoni focalizzati (Figura 2)

1. Rimuovere l'animale dalla culla per la risonanza magnetica dopo il completamento della scansione e posizionarlo sulla piattaforma inserendo la parte anteriore del letto nel piolo corrispondente sul retro della piattaforma e inserendo la parte posteriore del letto nel piolo corrispondente.

2. Collegare il tubo di ingresso del letto MRI a una fonte di isoflurano per l'anestesia e impostare la portata del gas a 1,0 ml/min e il vaporizzatore al 2,0% per il mantenimento dell'anestesia. Collegare il tubo di uscita a un contenitore del filtro al carbone per l'assorbimento dell'anestesia.

3. Trasferire il set di file DICOM sul computer e inserirli in una cartella nella directory di lavoro principale dello studio corrente.

4. Nel software, vai alla pagina principale di inizializzazione e attiva la modalità Jog facendo clic su Guided Focus Finding e quindi facendo clic su Jog Mode On.

5. Metti una piccola quantità di gel centrifugato per ultrasuoni sulla testa dell'animale, con abbastanza gel da coprire l'intero cuoio capelluto sopra il cranio.

6. Versare l'acqua deionizzata (DI) e degassata nel bagnomaria fino all'80%, quindi inserire il bagnomaria sulle colonne corrispondenti sulla piattaforma.

7. Abbassare il bagnomaria riempito con acqua deionizzata fino a quando la membrana inferiore tocca il gel per ultrasuoni sulla testa dell'animale, formando una superficie di accoppiamento tra l'acqua e il gel. Assicurarsi che il gel per ultrasuoni copra l'intera testa dell'animale fino al bagnomaria e che non ci siano bolle d'aria nel gel per ultrasuoni tra il bagnomaria e il cuoio capelluto del topo.

8. Immergere il trasduttore a ultrasuoni nel bagno d'acqua, assicurandosi che non si formino bolle d'aria sulla superficie del trasduttore.

9. Abbassare il braccio del trasduttore utilizzando la modalità Jog Down verso il trasduttore parzialmente sommerso e accoppiarlo al trasduttore allineando le fessure magnetiche tra loro mentre la superficie del trasduttore rimane sommersa.

10. Disattivare la modalità jog, quindi uscire da Ricerca mirata, come fatto durante la fase di inizializzazione. Assicurati di confermare la posizione iniziale come fatto in precedenza.

11. Vai alla scheda del trattamento e quindi carica i file di risonanza magnetica pesati in T1 post-contrasto facendo clic sull'icona della cartella nella parte superiore centrale dello schermo. Selezionare la cartella contenente i file DICOM caricati in precedenza sul computer e aprirli. Questo passaggio dovrebbe caricare automaticamente tutti i file DICOM nel pannello in alto a destra.

12. Successivamente, nella scheda Modalità sonicazione, selezionare la modalità di trattamento appropriata scegliendo Burst o Continuous Wave. Se in modalità burst, nella scheda Sonication Settings (Impostazioni di sonicazione), immettere la lunghezza del burst, il periodo di burst e il numero di periodi. Questi parametri corrisponderanno a ciascuna posizione di sonicazione. Se in modalità onda continua, inserire solo la durata della sonicazione.

NOTA: In questo studio, la modalità a onda continua è stata utilizzata per una durata di 120 s.

13. Fare clic sull'icona del bersaglio nella parte superiore centrale della pagina e selezionare le posizioni corrette sulla fetta di risonanza magnetica corretta in cui deve essere puntata la regione focale degli ultrasuoni focalizzati (FUS). Quando si fa clic su di esso, sarà presente un quadrato rosso chiaro con un cerchio rosso. È possibile scegliere più di una selezione.

14. A sinistra dell'immagine MRI c'è una tabella, che verrà popolata con le coordinate 3D delle regioni focali selezionate. Nell'ultima colonna della tabella, inserire il livello di potenza da sonicare in ogni punto focale, che può essere calcolato separatamente per ogni trasduttore utilizzato per ottenere i livelli di pressione o intensità desiderati. Fare clic su ciascun punto focale nella tabella per confermare che le coordinate verranno evidenziate e la regione focale corrispondente sull'immagine diventerà blu. nota: Fare riferimento alla scheda tecnica del trasduttore per determinare come tradurre il livello di potenza inserito nella tabella in pressione o intensità, poiché questi valori sono specifici del trasduttore.

15. Una volta soddisfatte tutte le regioni focali, selezionare Test di movimento. Ciò richiederà al software di spostare il trasduttore su tutti i punti focali per garantire che i movimenti siano possibili. Dopo la conferma, il software indicherà Motion Test Complete. Se si verifica un errore, regolare le regioni focali in modo che possano adattarsi agli assi 3D dei motori del trasduttore.

16. Una volta pronto, selezionare Inizia sonicazione per iniziare il protocollo di sonicazione, spostando il trasduttore e applicando i parametri FUS corretti in ogni regione focale selezionata.

17. Una volta terminato il protocollo di sonicazione, sganciare il trasduttore dal braccio del trasduttore, rimuovere il bagno d'acqua dalla piattaforma e rimuovere il gel per ultrasuoni dal cuoio capelluto dell'animale.

18. Svitare le barre per il morso e l'orecchio, rimuovere l'animale dal letto per la risonanza magnetica, quindi posizionare l'animale su un cuscinetto caldo fino a quando l'animale non si sveglia dall'anestesia. A questo punto, rimettete l'animale nella sua gabbia.

19. Per gli animali successivi, ripetere lo stesso protocollo, a partire dalla sezione 6. 20. Una volta trattati gli animali desiderati, pulire tutte le superfici toccate dagli animali con etanolo al 70% (vedi Tabella dei materiali).

21. Uscire dal software, quindi spegnere e spegnere ogni apparecchiatura.

Risultati

Figura 1: Posizionamento degli animali. (A) Lettino e culla per risonanza magnetica, con varie parti etichettate: 1. Culla per risonanza magnetica. 2. Lettino per risonanza magnetica stereotassica. 3. Barre auricolari. 4. B...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
7T Sistema PET-MR	Bruker	Biospec 70/30
Foglio	di alluminio Reynolds Brand
Amplifier	FUS Instruments	2175
Topi nudi atimici	Charles River Laboratories	Strain Code 490
Contenitore per rifiuti di isofluoro di carbone	Patterson scientific	78909457
Computer	FUS Instruments	2269
Vetro di copertura	Fisherbrand	12-545J
Monitor da tavolo	ASUS	VZ239H
Rasoio	elettronicoWahl	93235-002
Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientific	16000044 Generatore di
funzioni	Siglent	QS0201X-E01B
Agente di contrasto al gadolinio (Gadavist)	McKesson Corporation	2068062
Garza	Henry Schein	101-4336
Lampada termica
Termoforo	Kent Scientific	RT-0501
Camera di induzione	Patterson scientific	78933388
Vaporizzatore di isofluorano	Patterson scientific	78916954
Isoflurano	Covetrus	29405
Sistema di isoflurano	Patterson Scientific
spettro IVIS:	Perkin Elmer	124262
Nair	Church e Dwight Co.
Unguento oftalmico Unguento			veterinario Puralube
RK-50 Sistema MRgFUS	FUS Strumenti	2182
Scala Lama
per bisturi	Covetrus	7319
Manico per bisturi	Strumenti di scienze fini	91003-12
Set di cacciaviti	Jakemy	JM-8160
Marcatore cutaneo	Time Out	D538.851
Telaio stereotassico	Kopf Instruments	5000
Prototipo di risonanza magnetica stereotassica dispositivo di imaging in plastica	FUS Instruments
Trasduttore e scatola corrispondente	FUS Instruments	T515H750-118
Degasatore ad ultrasuoni	FUS Instruments	2259
Gel per ultrasuoni	ParkerLabs	01-08
Bagno d'acqua	FUS Instruments
Xilazina	Covetrus	1XYL006

7893590342010553