Costruzione di un'interfaccia nervosa periferica rigenerativa composita in un modello di lesione nervosa di ratto

Abstract

Fonte: Svientek, S. R., et al. Fabbricazione dell'interfaccia nervosa periferica rigenerativa composita (C-RPNI) nel ratto adulto. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la costruzione chirurgica di un'interfaccia nervosa periferica rigenerativa composita (C-RPNI) in un modello di ratto di lesione del nervo periferico. La procedura prevede l'applicazione di un nervo peroneo sezionato a un innesto muscolare e la sovrapposizione con un innesto cutaneo dermico per promuovere la rigenerazione dei nervi. Nel corso del tempo, i neuroni motori e sensoriali ristabiliscono le connessioni all'interno degli innesti, consentendo la formazione di strutture neuromuscolari e sensoriali funzionali.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

NOTA: Ai ratti donatori è consentito l'accesso gratuito a cibo e acqua prima delle procedure di donazione di pelle e muscoli. L'eutanasia viene eseguita in anestesia profonda seguita da iniezione intracardiaca di cloruro di potassio con un metodo secondario di pneumotorace bilaterale. Qualsiasi ceppo di ratto può teoricamente essere utilizzato con questo esperimento; tuttavia, il nostro laboratorio ha ottenuto risultati costanti sia nei ratti Fischer F344 maschi che femmine (~200-250 g) da due a quattro mesi di età. I ratti donatori devono essere isogeni rispetto ai ratti da esperimento.

1. Preparazione dell'innesto dermico

1. Anestetizzare il ratto donatore in una camera di induzione utilizzando una soluzione di isoflurano al 5% in ossigeno a 0,8-1 L/min. Una volta che il ratto è stato anestetizzato, rimuoverlo dalla camera di induzione e posizionarlo su un cono nasale rirespirante, abbassando l'isoflurano al 2-2,5% per il mantenimento dell'anestesia.
2. Somministrare una soluzione di 0,02-0,03 mL di Carprofene (50 mg/mL) in 0,2 mL di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea tra le scapole per l'analgesia.
3. Applicare unguento lacrimale artificiale su entrambi gli occhi per prevenire le ulcere corneali.
4. Usando il tagliaunghie, radere l'intero arto posteriore inferiore, la regione della caviglia e i lati delle zampe.
5. Detergere l'arto posteriore scelto e la superficie plantare della zampa con alcol, seguito da una soluzione di iodopovidone, terminando con una pulizia finale con alcol per rimuovere lo iodopovidone residuo.
6. Utilizzando un trapano ad alta velocità con micromotore portatile con una pietra lucidante rotonda a grana fine rimovibile (4000 giri/min), sbavare la superficie plantare della zampa per rimuovere l'epidermide. Durante la sbavatura, applicare gocce di soluzione salina per non bruciare la pelle. Il derma sottostante avrà un aspetto lucido con sanguinamento puntiforme.
7. Applicare un laccio emostatico sull'arto inferiore per rallentare il flusso sanguigno.
8. Rimuovere bruscamente la pelle plantare con un bisturi #15 e metterla in una garza inumidita con soluzione salina per evitare l'essiccazione. Parte del tessuto tendineo e connettivo verrà intrinsecamente rimosso con la pelle in questa fase e verrà rimosso in seguito.
9. Applicare una garza sul piede sanguinante per rallentare l'emorragia. Ripetere i passaggi 1.5-1.9 se si eseguono due costrutti.
10. Al microscopio (ingrandimento 20x), rimuovere il tessuto tendineo e connettivo dallo strato profondo dell'innesto cutaneo utilizzando le microforbici. Fare attenzione a non fare buchi nell'innesto. L'innesto dermico assottigliato deve essere leggermente opaco e contenere solo il derma, di dimensioni pari o superiori a 0,5 cm x 1,0 cm.
11. Mettere in una garza inumidita con soluzione salina fino al momento della fabbricazione del costrutto C-RPNI. Gli innesti devono essere utilizzati entro 2 ore dal raccolto.

2. Preparazione dell'innesto muscolare

1. Praticare un'incisione longitudinale lungo la faccia anteriore dell'arto posteriore inferiore da appena sopra la caviglia a appena sotto il ginocchio con un bisturi #15. Sezionare il tessuto sottocutaneo per esporre la muscolatura sottostante.
2. Sulla faccia distale dell'incisione, esporre le inserzioni tendinee della muscolatura degli arti inferiori. Il tibiale anteriore (TA) è in genere il più grande e il più anteriore dei muscoli, e appena sotto e posteriormente a questo muscolo si trova l'estensore lungo delle dita (EDL). Isolare il tendine EDL distale dagli altri tendini della zona, facendo attenzione a non inciderne l'inserzione in questo punto.
3. Garantire l'isolamento del tendine corretto inserendo entrambi i denti di una pinza sotto il tendine ed esercitando una pressione verso l'alto aprendo la pinza per provocare l'escursione del tendine. La manipolazione di questo tendine dovrebbe causare l'estensione simultanea di tutte le dita dei piedi.
4. Eseguire una tenotomia distale con forbici affilate dell'iride e separare il muscolo dai tessuti circostanti senza mezzi termini con tenotomie (o altre forbici a punta smussata), lavorando prossimalmente per trovare l'origine tendinea.
5. Una volta visualizzato il tendine prossimale, eseguire nuovamente una tenotomia utilizzando forbici affilate per l'iride. Posizionare l'innesto muscolare in una garza inumidita con soluzione salina per evitare l'essiccazione.
6. Una volta che tutti gli innesti desiderati sono stati rimossi da un ratto donatore, eseguire l'eutanasia principalmente mediante iniezione intracardiaca di KCl (1-2 mEq K+/kg) seguita da eutanasia secondaria con pneumotorace da puntura bilaterale con una lama #15.

3. Isolamento e preparazione del nervo peroneo comune

1. Anestetizzare e fornire analgesia al ratto sperimentale secondo il protocollo delineato nei passaggi 1.1-1.3.
2. Radere la coscia desiderata e detergere con alcol, betadina e terminare con alcol per rimuovere le tracce di betadina.
3. Spostare l'animale dal tavolo di preparazione chirurgica al tavolo del microscopio operatorio e posizionarlo su un termoforo con una sonda di temperatura per il mantenimento della temperatura corporea. Mantenere l'isoflurano al 2-2,5% e l'ossigeno a 0,8-1 L/min.
4. Segna l'incisione, che si estende dalla tacca distale a quella sciatica fino alla parte inferiore del ginocchio. Questa marcatura dovrebbe essere inferiore e angolata lontano dal femore. Praticare l'incisione con una lama #15, incidendo attraverso la fascia del bicipite femorale sottostante.
5. Sezionare con cura il muscolo bicipite femorale con un emostatico o con microforbici a punta smussata nello spazio sottostante il bicipite femorale.
   NOTA: Il nervo sciatico viaggia approssimativamente nella stessa direzione dell'incisione iniziale che è stata praticata. Ci sono tre rami, tipicamente con il nervo surale posteriore e il nervo peroneo e tibiale comune che viaggiano rispettivamente in superficie e in profondità fino al ginocchio.
6. Dopo l'identificazione del nervo peroneo comune (CP), utilizzando un paio di micro pinze a punta fine e microforbici, isolare accuratamente il nervo CP dagli altri rami sciatici e rimuovere distalmente il tessuto connettivo persistente.
7. Nel punto in cui il nervo attraversa la superficie del ginocchio, sezionare bruscamente il nervo con un paio di microforbici.
   NOTA: L'uso di forbici affilate è estremamente importante in questa fase, poiché causare un trauma significativo al nervo potrebbe aumentare il rischio di formazione di neuromi.
8. Liberare con cura il tessuto connettivo rimanente dal nervo CP e lavorare prossimalmente per liberare il nervo a una lunghezza di circa 2 cm.

4. Fabbricazione del costrutto C-RPNI

1. Rimuovere l'innesto muscolare dalla garza inumidita con soluzione salina e rimuovere tutto il tessuto tendineo centrale e un piccolo segmento centrale dell'epimisio. Lasciare intatte le estremità tendinee.
2. Usando un 8-0 sutura in nylon, fissare l'epinevrio dell'estremità sezionata del nervo CP all'area dell'innesto muscolare priva di epimisio con due punti interrotti su entrambi i lati del nervo.
3. Fissare l'innesto muscolare al periostio del femore con un singolo punto interrotto in nylon 6-0 sia prossimalmente che distalmente, con la giunzione nervo-muscolare rivolta lontano dal femore.
   NOTA: Fissare il muscolo in modo che sia a una lunghezza normale e rilassata. Cerca di non allungare il muscolo in modo significativo o di lasciare troppa lassità durante il fissaggio.
4. Piazzare un 8-0 punto di nylon sul margine inferiore e centrale dell'epimisio dell'innesto muscolare, fissandolo all'epinevrio del nervo CP in modo da creare lassità nel nervo all'interno dell'innesto muscolare e aiutare ad alleviare qualsiasi tensione futura a cui potrebbe essere esposto con la deambulazione successiva.
5. Rimuovere l'innesto cutaneo dalla garza inumidita con soluzione salina e disporlo sull'innesto muscolare in modo tale da coprire completamente il nervo e la maggior parte del muscolo. Assicurarsi che il margine profondo del derma poggi sul muscolo. Taglia il derma che si estende oltre il bordo del muscolo.
6. Fissare l'innesto cutaneo all'innesto muscolare in modo circonferenziale utilizzando 8-0 suture interrotte in nylon. In genere, vengono utilizzate 4-8 suture totali a seconda delle dimensioni del costrutto.
7. Chiudere la fascia del bicipite femorale sopra il costrutto in modo da correre con una sutura cromica 5-0.
8. Chiudere la pelle sovrastante con una sutura cromica 4-0 in modalità corsa.
9. Tamponare l'area chirurgica con un tampone imbevuto di alcol e applicare un unguento antibiotico.
10. Cessare l'anestesia per inalazione e consentire al ratto di riprendersi con fonti di cibo e acqua separate dai compagni di gabbia.

Materials