Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.
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Articolo metodologico
Saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il mondo vivido degli odori è riconosciuto dal senso dell'olfatto. Olfatto nei topi è mediata da un repertorio di circa 1200 recettori delle proteine G accoppiate (GPCR) 1 che sono postulate di legare molecole odoranti volatili e convertendo il segnale extracellulare in un segnale intracellulare mediante accoppiamento con proteine G Gαolf. Legame del odoranti ai recettori si pensa di seguire una regola combinatoria, cioè, un odorizzante può legare i recettori diversi e un recettore può legare odori diversi a vari livelli 2. Biochimiche, di segnalazione e studi di binding ligando sono stati opportunamente eseguiti per la maggior parte GPCR utilizzando cellule eterologhe. Tuttavia l'uso di cellule eterologhe per lo studio dei recettori olfattivi, è stato precluso per molto tempo da quando il transfezione non sono riusciti ad esportare verso la superficie. Saito et al hanno dimostrato singolo passaggio del recettore di membrana Il trasporto delle proteine (RTP) accompagnatori famiglia mostrano maggiore espressione nei neuroni olfattivi e sensoriali agiscono come accompagnatori di recettori olfattivi traffico in superficie in cellule eterologhe, quando co transfettate insieme 3. Per effettuare test biochimici per i recettori utilizzando cellule eterologhe, si deve prima determinare se il recettore mostra espressione robusta superficie nella linea cellulare. Questo può essere dosati con iperespressione del recettore con i RTP1S chaperone seguita da cellule vive colorazione fluorescente di etichettare il dominio extracellulare o di un tag nel dominio extracellulare in esclusiva. Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.
Protocollo
1. Procedimento:
La procedura si compone di tre parti completato in un tempo totale di 3 giorni: il trasferimento di cellule, trasfezione e immunocitochimica, un passo effettuato al giorno. Trasferimento e trasfezione delle cellule nei primi due giorni deve essere effettuato in condizioni sterili in una camera a flusso laminare.
1 ° giorno: Trasferimento di cellule HEK293T per test espressione sulla superficie.
- Trasferimento medio (M10): Mix minimo mezzo fondamentale integrato con il 10% (in volume) siero fetale bovino in confezione sterile.
- Crescere le cellule ad una confluenza desiderata in....
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Discussione
Ogni passo deve essere effettuata con cura per garantire la colorazione della superficie prominente e distintivo. L'intero processo di colorazione deve essere eseguita a freddo (su ghiaccio), e il vassoio su cui sono previsti slittamenti di copertura deve essere raffreddato prima dell'uso per assicurare cellule rimanere in vita. Inoltre la fissazione avviene al termine del processo di colorazione della superficie. Ciò è in netto contrasto con la colorazione interna in cui la fissazione precede colorazione a perm.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri della Matsunami laboratorio per la lettura critica di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coprioggetto 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Siero fetale bovino | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mezzo essenziale minimo | Sigma-Aldrich | M4655 | Con L glutammato, sale di Earle’s e bicarbonato |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldeide | EMS | 19208 | |
| Soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | Con cloruro di calcio e cloruro di magnesio |
| Soluzione tampone HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Senza calcio e magnesio |
| Poli D Lisina Idrobromuro | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Azoturo di sodio | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Piastra per colture cellulari 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Tripsina-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
Riferimenti
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
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Ristampe e permessi
