Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

neurogenesi corticale: transizione dai progressi nel laboratorio di terapie basate sulle cellule

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesi corticale: Transizione dai progressi nel laboratorio di terapie basate sulle cellule

Mi chiamo Arnold Krickstein. Sono il direttore dell'Istituto di Medicina Rigenerativa qui all'UCSF e il mio campo di interesse è la neurobiologia dello sviluppo. In particolare, siamo molto interessati alle fasi iniziali dello sviluppo corticale e abbiamo studiato le cellule staminali neurali e le cellule progenitrici, analizzando il modo in cui generano i neuroni e come questi ultimi migrano e iniziano a formare circuiti nel cervello in via di sviluppo, specialmente nella corteccia.Bene, l'avvento dell'elettroporazione in utero, penso sia stata una di quelle tecnologie trasformative introdotte da SDO e dai suoi colleghi per lo studio delle fasi iniziali dello sviluppo cerebrale, poiché consente di effettuare esperimenti di acquisizione e perdita di funzione per una vasta gamma di geni. E di farlo in modo relativamente semplice introducendo direttamente tali geni nelle cellule staminali neurali e nelle cellule progenitrici che generano neuroni durante lo sviluppo corticale precoce. La tecnica consiste essenzialmente nell'iniettare DNA sotto forma di un plasmide nei ventricoli cerebrali di un animale in stadio embrionale, per poi applicare una breve corrente elettrica che spinge tali plasmidi all'interno delle cellule che rivestono i ventricoli, ovvero le cellule di tipo neuroepiteliale radiali GL che successivamente producono neuroni e, in ultima analisi, cellule gliali.E ciò può includere l'uso di RNA interferenti corti che possono ridurre o silenziare l'espressione di geni specifici, oppure si possono sovraesprimere direttamente determinati prodotti genici. Entrambi questi tipi di esperimenti analizzano effetti complementari sul cervello in via di sviluppo. Le molecole bersaglio possono includere quasi qualsiasi elemento coinvolto nelle fasi iniziali dello sviluppo cerebrale o anche in fasi successive relative allo sviluppo o alla maturazione delle sinapsi.L'avvento di questa tecnica ha già avuto un effetto significativo sugli studi sul cervello in via di sviluppo e promette di avere un impatto ancora maggiore nel prossimo futuro. Le cellule che rivestono i ventricoli e che danno origine a tutti i neuroni e alle cellule gliali nel cervello si originano come cellule neuroepiteliali. Tuttavia, intorno al periodo in cui i neuroni iniziano a svilupparsi, queste si trasformano o iniziano a trasformarsi in un tipo di cellula gliale noto come cellula gliale radiale.Stabiliscono contatti specializzati con i vasi sanguigni e guidano la migrazione dei neuroni giovani. E in quel periodo iniziano a effettuare un interessante insieme di diversi tipi di divisione. Compiono una sorta di divisione progenitrice simmetrica, producendo ulteriori copie di se stesse, generando cioè due cellule gliali radiali ogni volta che si dividono.Inoltre, effettuano divisioni neurogeniche asimmetriche in cui si dividono e si autorigenerano, producendo ad ogni ciclo cellulare una cellula figlia che diventa un neurone. Tuttavia, si è scoperto che compiono anche un terzo tipo di divisione molto interessante, che è asimmetrica nel senso che le cellule figlie sono diverse: una è una cellula gliale radiale autorigenerata, mentre l'altra diventa un diverso tipo di cellula progenitrice.Definiamo questo un progenitore intermedio che migra lontano dal ventricolo e successivamente si divide generalmente in una diversa zona proliferativa nota come zona subventricolare. Il metodo dell'elettroporazione in utero rappresenta un modo pratico per introdurre questi DNA di silenziamento o di sovraespressione nelle cellule radio gliali durante le fasi in cui queste ultime effettuano diversi tipi di divisione. Abbiamo inoltre utilizzato un retrovirus che esprime la proteina verde fluorescente come marcatore di linea, iniettando questo marcatore virale nei ventricoli negli stessi stadi, per poter quindi seguire il destino di singole cellule marcate mentre si dividono e generano cloni di cellule figlie.E, grazie all'acquisizione temporale di immagini che effettuiamo nelle colture di tessuto in slice, possiamo seguire o tracciare le sorti finali di queste cellule mentre migrano verso la corteccia. Sebbene per lungo tempo si sia ritenuto che la zona ventricolare fosse la principale fonte di neurogenesi nel cervello in via di sviluppo, la zona subventricolare è stata progressivamente riconosciuta, almeno nell'embrione, come una fonte di notevole entità per la neurogenesi. Quello che abbiamo scoperto è che nella zona subventricolare, i progenitori intermedi, che originano a loro volta dai radial glia nella zona ventricolare, migrano in tale zona e si dividono in maniera simmetrica, generando o ulteriori progenitori intermedi autorinnovati oppure, attraverso una divisione terminale simmetrica, coppie di neuroni che successivamente migrano verso la corteccia.Pertanto, la zona subventricolare si sta rivelando una zona di neurogenesi molto importante e interessante nel cervello embrionale o in sviluppo. Inoltre, questi cellule progenitrici intermedie, mentre risiedono nella zona subventricolare, diventano cellule multipolari e sembrano avere la capacità di muoversi in modo tangenziale all'interno di tale zona. E questo potrebbe spiegare la dispersione delle linee cellulari che è stata osservata in studi precedenti, ad esempio da Walsh e S Cepco alcuni anni fa nella corteccia in sviluppo, utilizzando anche in quel caso retrovirus per tracciare il destino di quelle cellule.Beh, ad esempio, ci sono diversi geni interessanti che, come si è scoperto, sono coinvolti nella neurogenesi o nella migrazione neuronale. Nel nostro laboratorio abbiamo studiato le proteine delle giunzioni comunicanti, ovvero le connessioni che sottendono la formazione dei ben noti canali delle giunzioni comunicanti. Ma, cosa interessante, abbiamo scoperto che le cellule che migrano lungo i prolungamenti radiali gliali utilizzano effettivamente queste giunzioni comunicanti non come canali per la comunicazione, ma come molecole di adesione che consentono fisicamente ai neuroni e alle cellule in migrazione di aderire alle fibre radiali.E quegli studi sono stati effettivamente condotti utilizzando siRNA che hanno ridotto l'espressione di connessioni specifiche. Ad esempio, la connessione 43, che è espressa in modo molto elevato dai radio ggl e anche dai loro neuroni figli e dalle loro cellule progenitrici intermedie. Molti dei cosiddetti cellule staminali adulte che derivano dal cervello fetale, in realtà sono probabilmente radio che possono essere espansi in coltura quando vengono trattati con i fattori di crescita appropriati, come ad esempio il BFGF.Ma oltre a questi glia radiali, gli progenitori intermedi potrebbero rivelarsi un bersaglio molto interessante per la ricerca sulle cellule staminali perché riteniamo che producano effettivamente neuroni di un tipo cellulare molto ristretto. Pertanto, se una strategia prevede, ad esempio, la creazione di un gran numero di un tipo cellulare neuronale molto specifico, l'identificazione e l'isolamento delle cellule progenitrici intermedie responsabili della generazione di quel particolare tipo cellulare sarebbe probabilmente un approccio molto migliore rispetto, per esempio, alla creazione di un numero amplificato di glia radiali, che potrebbero produrre una grande varietà di tipi cellulari diversi. In effetti, negli studi condotti in vitro, quando si ampliano linee di cellule staminali embrionali e poi si generano singoli neuroni a partire da queste fonti di cellule staminali embrionali, sembra che la maggior parte di queste linee attraversi ciò che potrebbe essere persino una fase obbligatoria di tipo epiteliale o simile a quella dei glia radiali prima di generare effettivamente neuroni.Ad esempio, i protocolli utilizzati da Austin Smith per generare neuroni o cellule staminali neurali sono effettivamente molto simili ai radiali gliali. Essi subiscono una migrazione nucleare cinetica, esprimono fattori di trascrizione e marcatori dei radiali gliali, e generano neuroni e astrociti in modo molto simile a quello dei radiali gliali.E in modo analogo, Loren Ser e altri hanno utilizzato cellule staminali embrionali umane e hanno osservato che queste formano rosette, ovvero si autoassemblano in una struttura di tipo neuroepiteliale in vitro, prima ancora di generare neuroni. Ancora una volta, tali rosette sono composte da cellule che assomigliano molto alle cellule radiali gliali. Pertanto, l'idea che queste cellule radiali gliali rappresentino un tipo di cellula staminale neurale è, a mio parere, sostenuta da questo tipo di evidenze ottenute in vitro.Pertanto, prima dell'inizio della neurogenesi, esiste già un pattern regionale che si verifica in tutta la zona ventricolare in tutti i ventricoli e, in effetti, lungo tutto il midollo spinale. E quei geni del pattern espressi in regioni specifiche probabilmente limitano già il destino delle cellule figlie prodotte in quelle aree. Ad esempio, se si volessero generare cellule paramediali eccitatorie, le cellule radiali gliali corticali dorsali producono quel tipo cellulare; se invece si volessero produrre interneuroni, allora si dovrebbero utilizzare le cellule dell'eminenza gangliare, che generano quegli interneuroni, oppure oligodendrociti e così via.Pertanto, se la vostra strategia nella ricerca sulle cellule staminali, in termini di trattamento di una malattia, prevede la creazione di un gran numero di cellule di un tipo particolare, come un certo tipo di interneurone o un certo tipo di cellula di proiezione eccitatoria, allora gli studi sullo sviluppo, che stanno cominciando a rivelare le differenze tra la neurogenesi e queste distinte regioni cerebrali, forniranno probabilmente indizi che potranno essere utilizzati in seguito per progettare strategie volte ad ampliare neuroni di un tipo cellulare specifico, ad esempio per terapie cellulari di sostituzione. Il termine rigenerazione o medicina rigenerativa suggerisce effettivamente la capacità di rigenerare organi. E credo che la maggior parte del pubblico consideri le cellule staminali come un metodo per sostituire cellule e tessuti danneggiati.Ma in realtà, ritengo che i primi trattamenti derivanti dalla ricerca sulle cellule staminali coinvolgeranno l'uso delle cellule staminali in altri modi, forse più innovativi. Ad esempio, l'utilizzo della ricerca sulle cellule staminali in laboratorio per effettuare lo screening di farmaci mediante metodi ad alto rendimento, modellando malattie attraverso cellule umane anziché, ad esempio, cellule di topo in laboratorio. Per quanto riguarda le terapie cellulari, penso che in larga misura, anzi, ritengo che sia già iniziato ad essere utilizzato come veicolo di somministrazione, sfruttando ad esempio la capacità di certe cellule staminali di migrare verso aree di danno o malattia e di rilasciare un carico terapeutico, come un gene, un prodotto genico o un enzima mancante, e così via.L'applicazione che non prevede l'integrazione delle cellule in strutture organiche preesistenti, secondo me, rappresenta un obiettivo più immediato. E forse alcuni dei primi esempi di terapie cellulari coinvolgeranno proprio questo approccio piuttosto che il vero e proprio ripristino cellulare. Le attuali restrizioni federali sull'uso di fondi NIH per qualsiasi tipo di cellule staminali embrionali umane, eccetto un numero limitato, hanno avuto un effetto fortemente disincentivante sul campo.Ha tenuto alcuni giovani ricercatori lontani dal campo e ha impedito ad altri di esplorare effettivamente l'utilità potenziale delle cellule staminali embrionali in laboratorio. Sono stati compiuti tentativi per cercare di liberalizzare tali restrizioni. Come la maggior parte dei vostri spettatori probabilmente sa, il presidente ha posto il veto a un disegno di legge e, scusate, sta per porre il veto a un altro.La nostra speranza è che queste politiche cambino e che diventi possibile utilizzare i finanziamenti NIH per studiare un'intera gamma di linee staminali appena sviluppate, molte delle quali presentano vantaggi rispetto a quelle poche originarie create prima del 2001. Ma anche se fosse revocato il divieto di finanziamento, probabilmente non comporterebbe immediatamente, almeno all'inizio, un aumento dei finanziamenti per questo tipo di ricerca. E poiché questo progetto di legge, ad esempio quello proposto dal Congresso, non è un provvedimento di finanziamento o di stanziamento, avrà comunque un impatto facilitando a ricercatori come noi l'integrazione di lavori con linee definite approvate e non approvate all'interno dello stesso spazio di ricerca, nello stesso laboratorio e con l'uso delle stesse attrezzature o la condivisione di alcune risorse comuni.Tutto ciò rappresenterebbe un notevole miglioramento, ma è improbabile che porti a un affluxo consistente di sostegno effettivo, ovvero finanziamenti per la ricerca destinati a tali attività. Per questo, credo che dovremo ancora fare affidamento su fonti private, compresi i finanziamenti statali, che qui in California sono davvero una fortuna per i ricercatori nel campo delle cellule staminali, oltre che in California. Altri stati come New York, Connecticut e Massachusetts stanno seguendo lo stesso esempio e presto finanzieranno le proprie iniziative statali per la ricerca sulle cellule staminali.E penso che questo sarà un importante motore per spingere la ricerca in questo campo per tutto il futuro prevedibile, indipendentemente dal fatto che la politica del NIH cambi presto o meno.

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