Imaging bioluminescente della progressione del tumore al seno in un modello murino femmina

Abstract

Fonte:
Marina Arantes Radicchi¹, Victor Carlos Mello¹,
Victória Paz Machado¹, Márcia Cristina Oliveira da Rocha¹, Jaqueline Vaz de Oliveira¹, Luana Cristina Camargo^1,2, Luís Alexandre Muehlmann¹, Ricardo Bentes Azevedo¹, Sônia Nair Bao¹, João Paulo Figueiró Longo<sup>1

1</sup>Istituto di Scienze Biologiche, Università di Brasilia, ²Dipartimento di Processi Psicologici di Base, Istituto di Psicologia, Università di Brasilia

Questo video mostra la procedura per monitorare la progressione del tumore in vivo iniettando cellule di adenocarcinoma mammario che esprimono luciferasi in un topo femmina e monitorando i segnali bioluminescenti per valutare la crescita del tumore primario e metastatico nel tempo

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Coltura cellulare

1. Mantenere la linea cellulare 4T1 (ATCC-CRL-2539), una cellula di adenocarcinoma mammario murino, in coltura con terreno DMEM (terreno eagle modificato di Dulbecco) integrato con siero fetale bovino al 10% (v:v), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL), a 37 °C e in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
2. Trasfettare la linea cellulare originale con il gene Luc2, che esprime la luciferasi. Questo enzima bioluminescente è prodotto costitutivamente.

2. Modello animale - Trapianto di cellule tumorali

1. Inoculare per via sottocutanea cellule 4T1 bioluminescenti che esprimono luciferasi (2 × 10⁵ cellule per topo) nel dorso sinistro di topi femmina Balb/c sotto anestesia (ketamina e xilazina rispettivamente a 80 mg/kg e 10 mg/kg).
   1. Per questa procedura, anestetizzare il topo prima dell'esperimento utilizzando l'iniezione intraperitoneale degli agenti anestetici specificati (ketamina e xilazina rispettivamente a 80 e 10 mg/kg).
   2. Dopo 5 minuti di induzione dell'anestesia, radere il topo e iniettare le cellule per via sottocutanea utilizzando siringhe da insulina da 1 ml.
      NOTA: Un totale di cinque topi di 8 settimane, del peso di circa 25 g ciascuno, sono stati utilizzati per l'induzione del tumore e l'imaging.
2. Per quantificare la crescita tumorale in vivo, valutare il topo portatore di tumore mediante imaging bioluminescente, monitorando la crescita tumorale per 4 settimane.
   1. Per gli esperimenti di bioimaging, anestetizzare il topo con isoflurano (2,5% diluito in aria compressa purificata). Per valutare la progressione del tumore, eseguire l'imaging del topo una volta alla settimana per 4 settimane utilizzando apparecchiature che misurano i segnali bioluminescenti.
      NOTA: Il segnale bioluminescente della luciferasi 4T1-luc è stato utilizzato come parametro per valutare la crescita e indicare la progressione del tumore.
3. Durante il processo di imaging, posizionare il mouse in posizione sdraiata dorsale all'interno dell'area designata dell'apparecchiatura per acquisire le immagini bioluminescenti.
4. Dopo l'anestesia, iniettare nel topo D-luciferina (100 μL; 15 mg/mL) per via intraperitoneale.
   NOTA: Poiché la D-luciferina è un substrato per l'enzima luciferasi, che produce fotoni di luce quando viene scisso, e le cellule di luciferasi 4T1-bioluminescenti esprimono questo enzima costitutivamente, quantificare e rilevare il tumore negli animali vivi.
5. Per rilevare i segnali, acquisire 20 immagini bioluminescenti nell'arco di 20 minuti per ciascun animale in ogni punto finale. Ognuna di queste immagini rappresenta il segnale bioluminescente emesso in un periodo di 60 s.
6. Costruisci una curva cinetica bioluminescente che rappresenti il segnale emesso ogni minuto. Per garantire risultati ottimali per ogni animale, registrare l'emissione bioluminescente massima per ciascun endpoint.
7. Per l'acquisizione di immagini in bioluminescenza, utilizzare i seguenti parametri: filtro di emissione aperto, senza eccitazione, binning 8, f/stop 2 e campo visivo di tipo D. Per generare una curva di crescita, visualizza gli animali una volta alla settimana per un totale di 4 settimane.
8. Imaging a bioluminescenza - Tumore primario e metastasi polmonari.
   1. Per distinguere tra i segnali del tumore primario e delle metastasi polmonari, definire specifiche regioni di interesse utilizzando il software dell'apparecchiatura.
   2. Identificare i segnali bioluminescenti nel sito di iniezione e nella regione toracica in cui le cellule hanno metastatizzato. Sulla base di queste immagini, calcolare la progressione del segnale bioluminescente, che è fortemente correlato con la progressione del tumore.
   3. Con le immagini raccolte nell'arco di diverse settimane, creare un profilo della cinetica di crescita per i diversi siti tumorali, compreso il tumore primario e le lesioni metastatiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
D-luciferina	Perkin Elmer	122799	Reagente chimico
Il médium dell'Aquila modificato di Dulbecos	Gibko	Codice: A7030	Terreni di coltura cellulare
Siero fetale bovino	Merck	F2442	Supplemento ai terreni di coltura cellulare
Isoflurano	Cristália	NA	Anestetici
IVIS Lumina	XR	Serie III	Attrezzatura – USA
Penicillina	Merck	P4333	Antibiotico per colture cellulari
Falloidina-Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	Codice A12379	Reagente chimico
Soluzione salina tampone fosfato	Merck	4437568	Reagente chimico
Streptomicina	Merck	P4333	Antibiotico per colture cellulari