<ol style="margin-top: 0in"><li> Tagliare i pezzi di coda (3 mm) e le orecchie marchio. </li><li> Aggiungere 720 m l STE e 30 m l proteinasi K (10 mg / ml di brodo). </li><li> Incubare a 55 ° C sul blocco di riscaldamento e vortice ogni ora per 3 ore alla massima velocità per 10 secondi. </li><li> Inattivare proteinasi K a 70 ° C per 5 minuti. </li><li> Quench in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> Centrifuga DNA coda per 10 minuti a piena velocità. </li><li> Decantare in nuovo tubo contenente 720 m l Isopropanolo. &nbsp; </li><li> DNA precipitato, invertendo il tubo o vortex. </li><li> Spin down del DNA per 5 minuti alla massima velocità. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare pellet con etanolo al 70%. </li><li> Spin down DNA genomico 5 minuti a piena velocità. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lasciare DNA asciugare per 1-2 minuti. </li><li> Risospendere DNA in 100-200 l m a seconda delle dimensioni del pellet. </li><li> Tubo posto a 55 ° C per 1 ora per facilitare la dissoluzione del DNA. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / in H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

isolamento del dna genomico da tails mouse

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Questo è un topo di 10 giorni e preleverò un campione di biopsia dalla coda per estrarre il DNA genomico dal suo tessuto caudale. Procederò tagliando una piccola porzione della coda, di circa tre millimetri, quindi inserirò il frammento di coda in una provetta einor e posizionerò la provetta su ghiaccio secco. Per evitare contaminazioni da un topo all'altro, di solito segno la lama del rasoio nella zona in cui ho effettuato l'ultimo taglio.In questo modo, per il prossimo topo, mi assicurerò di utilizzare un pezzo pulito di lama di rasoio per prelevare il successivo frammento di coda. Per distinguere tra i diversi topi della vostra nidiata, avrete bisogno di un metodo per identificarli. Un modo per farlo è praticare un foro nelle loro orecchie utilizzando un perforatore auricolare, mostrato qui.Prendere delicatamente il topo per la nuca in questo modo, girarlo e pizzicare la coda tra le dita. Prendere il foro dell'orecchio con l'altra mano ed effettuare un rapido taglio nell'orecchio del topo in quel punto. Vedi quanto è stato indolore?Ok, ora potete vedere che ho alcuni pezzi di coda in queste provette e adesso aggiungerò le soluzioni che li aiuteranno a digerire. Per prima cosa aggiungerò 720 microlitri di soluzione STE e poi aggiungerò 30 microlitri di proteina Ace K. Ecco un'immagine del pezzo di coda che abbiamo tagliato prima della digestione.Ora posizionerò i frammenti di coda su un blocco riscaldante a 55 gradi. Molti protocolli prevedono un'agitazione continua a 55 gradi, ma ai fini del mio esperimento ciò non sarà necessario poiché agiterò i frammenti di coda con un vortex. Ora agiterò il frammento di coda per due secondi.Uno, due. Dopo la vortexazione, ecco come appare il contenuto rimasto all'interno del tubo einor; si può notare che il pezzo di coda è stato completamente disciolto. Attivare la proteinasi K a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Raffreddare sul ghiaccio per cinque minuti.Centrifugare i frammenti di coda in una microcentrifuga per 10 minuti a velocità massima. In questa microcentrifuga, la velocità massima corrisponde a 13.000 giri al minuto. Mentre i frammenti in digestione vengono centrifugati, etichettare alcuni tubi Eppendorf e riempirli con 750 microlitri di isopropanolo.Dopo aver centrifugato le code digerite, i peli e il materiale non digerito formeranno un pellet sul fondo del tubo. La soluzione contenente il materiale digerito, STE e proteinasi K verrà versata nel tubo Eppendorf contenente l’isopropanolo; il DNA inizierà a precipitare, assumendo un aspetto traslucido e filamentoso, e proprio lì, intorno a questa bolla, si troverà il DNA genomico isolato dalla coda del topo. Dopo aver mescolato la soluzione di isopropanolo e STE, il DNA genomico precipiterà assumendo l’aspetto di una piccola sfera proprio qui; centrifugare il DNA genomico precipitato per cinque minuti a velocità massima in una microcentrifuga.Qui, sul fondo del tubo, si può osservare il nostro DNA genomico in pellet. Ora aspirerò la soluzione all'interno del tubo, lasciando soltanto il pellet di DNA genomico. Ogni volta che aspirerò un altro tubo, cambierò la pipetta.Suggerimento: posizionare il suggerimento del pipet sulla punta di questo aspiratore. Dopo aver aspirato lo STE e l'isopropanolo, aggiungerò un millilitro di etanolo al 70% per lavare il pellet di DNA genomico. Poiché il pellet di DNA genomico di solito aderisce alla parete del tubo da microcentrifuga ed è difficile staccarlo per lavarlo completamente nell'etanolo al 70%, dovrete trascinarlo lungo la griglia per tubi da microcentrifuga che ho qui.È possibile procedere in questo modo. Ecco un'occhiata al DNA genomico dopo che è stato centrifugato e lavato con etanolo al 70%. Procederò nuovamente con una centrifugazione a velocità massima per cinque minuti, quindi aspirerò l'etanolo al 70%, centrifugando nuovamente i pellet di DNA genomico dopo il lavaggio.Il loro 70% di etanolo per cinque minuti a velocità massima, quindi aspirare il 70% di etanolo e lasciare asciugare il DNA per cinque minuti. Osservare il pellet di DNA genomico sul fondo del tubo, che deve risultare all'incirca così secco. Ho quindi completato l'essiccazione dei pellet di DNA genomico ottenuti dalle code dei topi, e ora aggiungerò cento microlitri di tris 40 millimolare a pH otto.Ho il DNA genomico a 50 gradi Celsius, dove si scioglierà più rapidamente rispetto all'aggiunta a temperatura ambiente. Dopo circa un'ora a 50 gradi, lo congelerò o lo metterò a quattro gradi fino a quando non vorrò eseguire le mie reazioni di PCR per determinare effettivamente quali topi sono positivi per il mio transgene.

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

In questo articolo

Protocollo

Materiali

Ristampe e permessi

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Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
STE	Tampone			100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / in H2O
TE	Tampone			100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl