Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Organotipica Culture Slice ippocampale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ippocampo, un componente del sistema limbico, gioca un ruolo importante nella memoria a lungo termine e la navigazione spaziale 1. Neuroni dell'ippocampo può modificare la forza delle loro connessioni, dopo brevi periodi di forte attivazione. Questo fenomeno, noto come potenziamento a lungo termine (LTP), può durare per ore o giorni ed è diventato il meccanismo miglior candidato per l'apprendimento e la memoria 2. Inoltre, l'anatomia ben definito e connettività dell'ippocampo 3 ha fatto un sistema modello per lo studio classico trasmissione sinaptica e 4 plasticità sinaptica.
Come la nostra comprensione della fisiologia delle sinapsi dell'ippocampo crebbe e giocatori molecolare è stato identificato, la necessità di manipolare proteine sinaptiche è diventato un imperativo. Organotipica culture dell'ippocampo offrono la possibilità di manipolazione genetica facile e preciso l'intervento farmacologico, ma mantenere l'organizzazione sinaptica che è fondamentale per comprendere la funzione sinapsi in un contesto più naturalistico di routine cultura metodi dissociato neuroni.
Qui vi presentiamo un metodo per la preparazione e la cultura fettine di ippocampo, che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Questo metodo permette di raggiungere facilmente le fette di manipolazione genetica utilizzando approcci diversi, come infezioni virali o 5,6 biolistics 7. Inoltre, fette può essere facilmente recuperato per le analisi biochimiche 8, o trasferiti ad microscopi per l'imaging 9 o esperimenti elettrofisiologici 10.
Protocollo
1. Prima di avviare la preparazione di fettine di ippocampo.
- Preparare l'affettatrice tessuto mettendo un pezzo di foglio di teflon e montare una nuova lama.
- Pulire la coltura del tessuto (TC) cappuccio con il 70% di etanolo e impostare l'interno microscopio da dissezione. Sterilizzare il cofano, microscopio, affettatrice tessuti e tutti gli strumenti di dissezione per 15 minuti con la luce UV.
- Preparare sei piastre TC. Aggiungere 750 microlitri terreni di coltura slice (SCM) per bene e posto inserti in colture cellulari in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le membrane sono completamente bagnato senza bolle sotto. Posizionare le....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo metodo si basa sul primo metodo descritto da Stoppini et al. 11 e offre un modo rapido a fette cultura dell'ippocampo. L'aspetto più importante di questo protocollo è quello di mantenere fette sterile, quindi è fondamentale utilizzare appropriate tecniche sterili e per disinfettare correttamente e sterilizzare tutto il materiale a contatto con il tessuto.
Diverse fonti sieri possono influenzare la qualità delle fette. Si consiglia di provare diversi lotti p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS - NIH R01NS060756
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Inserti per coltura cellulare | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Piastre a 6 pozzetti | BD Biosciences | 353046 | |
| Tagliatore di tessuti | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| Microscopio | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| Strumento per dissezione dell'ippocampo | F.S.T. | 10099-15 | |
| Forbici chirurgiche grandi. Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 Destra/Sinistra | |
| Spatola ad iris | F.S.T. | 10093-13 | |
| Spatola dritta | F.S.T. | 10094-13 | |
| Microspatola a cucchiaio arrotondata | VWR international | 57949-039 | |
| Ago da dissezione a singolo taglio | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| Pinzette da dissezione | Dumont | #2 | |
| Forbici da dissezione piccole | F.S.T. | 14060-10 | |
| Mezzo MEM Eagle | Cellgro | 50-019 PB | |
| Serum equino inattivato per riscaldamento | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-Glutammina (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Insulina (1 mg/ml), disciolta in HCl 0,01 N | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Acido ascorbico, soluzione (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-Glucosio | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Soluzione di rosso fenolo 0,5% in DPBS | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
Riferimenti
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Phi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
