Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell'orecchio interno

Sommario

Un metodo per fornire Morpholinos direttamente nel otocyst pesce zebra a 24hpf è stato sviluppato. Mediante microiniezione di Morpholinos nel lume del vescicola otica ed elettroporazione di effettuare la penetrazione, siamo stati in grado di bypassare l'effetto di Morpholinos sul cervello e ottenere effetti specifici per l'orecchio interno.

Abstract

Negli ultimi anni, elettroporazione è diventata una tecnica popolare per la transfezione in vivo di DNA, RNA, e Morpholinos in vari tessuti, tra cui l'occhio, il cervello, e somiti di zebrafish. Il vantaggio di elettroporazione rispetto ad altri metodi di manipolazione genetica è che i tessuti specifici possono essere mirati, sia spazialmente e temporalmente, per l'introduzione di macromolecole con l'applicazione di corrente elettrica. Qui si descrive l'utilizzo di elettroporazione per la trasfezione mif e mif-come Morpholinos nei tessuti dell'orecchio interno lo sviluppo del pesce zebra. In studi precedenti, mif morfolino iniettate in embrioni a 1 - a stadio di 8 cellule portato a cambiamenti morfologici diffusi nel sistema nervoso e degli occhi, così come l'orecchio. Prendendo di mira i tessuti dell'orecchio interno nelle fasi successive dello sviluppo, possiamo determinare gli effetti primari di MIF nell'orecchio sviluppo interno, al contrario di effetti secondari che possono derivare da l'influenza di altri tessuti. Utilizzando tubulin falloidina e acetylated colorazione per studiare la morfologia dei neuroni, processi neuronali e cellule ciliate associati con la macula posteriore, siamo stati in grado di valutare l'efficacia di elettroporazione come metodo per la trasfezione mirati nell'orecchio zebrafish interno. Le vescicole otic di embrioni 24hpf sono stati iniettati con Morpholinos e elettroporate e sono stati poi confrontati con embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento o erano stati solo iniettato o elettroporate. Embrioni che sono stati iniettati e elettroporate ha mostrato una diminuzione del numero delle cellule dei capelli, diminuzione della innervazione dal ganglio statoacoustic (SAG) e neuroni SAG meno rispetto ai gruppi di controllo. I nostri risultati hanno mostrato che la consegna diretta dei Morpholinos in otocysts nelle fasi successive evita la non specifico del sistema nervoso e gli effetti della cresta neurale Morpholinos consegnato in fase di 1-8 cellule. Consente inoltre l'esame degli effetti che sono diretti per l'orecchio interno e non effetti secondari su un orecchio da effetti primari sul cervello, cresta neurale o mesenchima periotica.

Protocollo

1. Fare Elettrodi per elettroporazione

1. Tagliare 75 micron diametro del filo di tungsteno (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) di lunghezza adeguata (circa 3-5 cm)
2. Mettere filo di tungsteno attraverso molex cavo connettore (pin ottone stampato)
3. Avvolgere i fili di tungsteno e il connettore del cavo molex con guaina termorestringente (SPC Technology, Chicago, IL) e al calore di becco Bunsen o pistola ad aria calda per sigillare il tubo riducendo al filo
4. Per affilare la punta del filo di tungsteno, immergere il filo in idrossido di sodio 1,0 N (Conrad et al. 1993) e, usando una graffetta come l'altro elettrodo, elettrolizzare il filo con un Elettroporatore onda quadra. Le condizioni che usiamo sono 5 da 50 Volt impulsi di ciascuna della durata di 100 ms con 50 ms tra gli impulsi. Elettrodi deve essere affilato ad un diametro di 15-20 micron
5. Tenere i fili in un vassoio all'interno di scanalature premuto in plastilina prima dell'uso in elettroporazione

2. Configurazione Stazione di elettroporazione

1. Nastro affilato 75μm elettrodi di tungsteno di micromanipolatori (strumenti di precisione World).
2. Micromanipolatori posto su entrambi i lati del palco microscopio da dissezione (Leica).
3. Collegare gli elettrodi ad un cuy-21 Proteggere Elettroporatore Modifica Onda quadra (Figura 1).
4. Accendere il elettroporatore e impostare i parametri per l'elettroporazione, tra tensione, durata dell'impulso e il numero di impulsi. I parametri più efficaci per questo esperimento sono risultati essere tre 13-volt impulsi che ogni durato 5.0ms, con 100 ms tra ogni impulso. Se elettroporazione crea bolle d'aria nell'embrione, ridurre la lunghezza degli impulsi.

3. Microiniezione di Morpholinos Into Zebrafish vescicole Otic

1. Zebrafish embrioni raccolta da un serbatoio di allevamento. Incubare gli embrioni in embrione di sensibilizzazione di media con 0,3 PPM blu di metilene (Westerfield, 2005) a 28,5 ° C durante la notte.
2. Tirare aghi di vetro con un estrattore Sutter P-97 elettrodi
3. Caldo di un gel di base (1% agarosio in acqua i pesci in un piatto da mm 10 Petri) a 37 ° C in un bagno d'acqua
4. Riscaldare 1% agarosio a basso punto di fusione (LMPA) in acqua i pesci fino al fuso e tenerlo caldo nel bagno d'acqua a 37 ° C.
5. Riempire un ago di vetro con una soluzione morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) e tagliare la punta di diametro adeguato. Montare l'ago per l'iniezione su un micromanipolatore (Kuhn).
6. Taglio punta dell'ago a circa 10 micron ed iniettarlo in olio minerale per garantire che la punta permette di consegna sufficiente di soluzione morfolino.
7. Dechorinate embrioni postfertilization a 24 ore (HPF) e anestetizzare con MS222 (tricaine, Sigma) in 0,3 PPM acqua di metilene di pesce azzurro.
8. Allinea 3-5 embrioni anestetizzato sulla base di gel con il lato destro per comodo analisi uniforme
9. Mettete 1-2 gocce di 1% LMPA su ogni embrione e lasciate solidificare per fissare l'embrione in posizione
10. Ruotare la piastra Petri in modo che la vescicola otica si trova sul lato destro
11. Posizionare l'ago nel lume della vescicola otica e iniettare la soluzione morfolino con un pneumatico PV820 PicoPump (Strumenti di precisione mondiale) con un serbatoio di azoto allegato (Figura 2)

4. Procedura di elettroporazione

1. Spostare gli embrioni montato la stazione elettroporazione immediatamente dopo l'iniezione
2. Posizionare l'elettrodo positivo sul tessuto appena posteriormente alla vescicola dell'orecchio, ma non penetrano; inserire l'elettrodo negativo nel cervello appena anteriormente alla vescicola otica
3. Applicare corrente utilizzando un pedale o premendo un interruttore.
4. Versare l'acqua i pesci su agarosio e rimuovere gli embrioni di agarosio, rimestando e una pipetta di vetro. Fare attenzione a non danneggiare gli embrioni. Per gli embrioni che sono difficili da rimuovere, utilizzare un ago per rompere delicatamente via qualsiasi LMPA che circonda l'embrione.
5. Embrioni posto in un piatto di pesce con l'acqua di blu di metilene ed aumentare il embrioni a stadi desiderato per l'analisi (morfologica, immunoistochimica, ibridazione in situ anlaysis, etc e microscopici).

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Stazione di elettroporazione. Elettrodi sono stati realizzati con fili di tungsteno affilati 75μm e collegati da porta ad un cuy-21 onda Proteggere Modifica Piazza Elettroporatore. Questi elettrodi sono state registrate a micromanipolatori.

Figura 2. Stazione di iniezione. Tutti gli embrioni sono stati iniettati nel orecchio destro a fini di normalizzazione.

Figura 3. Colorazione falloidina di filamenti di actina con 3 embrioni dpf. (A) L'embrione injecte 3 dpfd con controllo MO ha colorazione forte falloidina nella macula posteriore (pm). (B) L'embrione che è stato iniettato con il controllo MO e poi elettroporate avevano livelli simili di colorazione in falloidina pm negli embrioni di iniezione unica. (C) Iniezione con MOS mif nella vescicola otica da solo non ha causato la riduzione di colorazione falloidina, mentre l'iniezione di Mos mif con elettroporazione causato una drastica riduzione di colorazione falloidina nel pm (D). Sono, macula anteriore.

Figura 4. Colorazione falloidina di filamenti di actina con 5 larve dpf. Non c'era alcuna differenza tra l'iniezione solo (A) e iniezione con elettroporazione, quando lo standard di controllo morfolino è stato utilizzato (B). Tuttavia, i 5 larve dpf che sono stati iniettati con mif Morpholinos e elettroporate hanno evidenziato una ridotta colorazione falloidina nella macula posteriore (pm) (D), anche se meno drammatico di 3 dpf, se confrontato con l'embrione che è stato iniettato con mif Morpholinos solo (C ). Sono, macula anteriore.

Figura 5. Colorazione tubulina acetilato di embrioni a 3 dpf. L'embrione in (A) non ha ricevuto alcuna iniezione o elettroporazione. L'embrione in (B) è stata elettroporate ma non ha ricevuto l'iniezione. Ricevere embrioni a iniezione e elettroporazione (C, D) con mif Morpholinos era visibilmente diminuito tubulina colorazione rispetto ai controlli. (Pm, macula posteriore).

Figura 6. Colorazione tubulina acetilato di embrioni a 3 dpf con controllo morfolino. (A) degli embrioni, senza alcun trattamento ha mostrato una forte colorazione tubulina acetilata nella macula posteriore (pm) e innervazione estesa. (B) degli embrioni iniettati con controllo morfolino. (C) degli embrioni trattati con elettroporazione solo. (D) embrione di controllo con il controllo morfolino iniettato e elettroporate ha livelli simili di tubulina acetilata nella macula posteriore e innervazione rispetto al non trattamento di controllo.

Discussione

Noi abbiamo introdotto con successo MOS oligonucleotide antisenso nell'orecchio dell'embrione 24 zebrafish HPF. Embrioni che sono state sollevate dopo l'iniezione ed elettroporazione sono stati vitali. Se gli embrioni sono sopravvissuti l'elettroporazione, sono cresciuti a tassi normali rispetto agli embrioni che avevano ricevuto alcun trattamento, così come gli embrioni che erano stati soltanto iniettato e gli embrioni che era stato solo elettroporate.

Abbiamo osservato gli effetti della commissione interbancaria multilaterale e mif-MOS, come dopo l'iniezione orecchio ed elettroporazione attraverso l'etichettatura con falloidina e tubulina acetilata. Colorazione falloidina di filamenti di actina in cellule ciliate sensoriali della macula posteriore indica che l'elettroporazione di mif e mif-come MO al 24-HPF stadio causato cambiamenti nella cella dei capelli e / o numeri stereocilia rispetto agli embrioni che erano solo iniettato il MOS (Figura 3). Questa diminuzione del numero di cellule dei capelli è coerente con i risultati di Shen et al. (Inviato) che MOS a mif e mif simile a causare una riduzione del numero di cellule ciliate nella macula sacculare. La diminuzione del numero di cellule dei capelli in embrioni che sono stati iniettati con MOS e elettroporate dimostrare che elettroporazione può aiutare nello spostamento del MOS attraverso la membrana cellulare, aumentando così la portata degli effetti morfologici rispetto agli embrioni in cui la vescicola otica era solo iniettato. I cambiamenti nella morfologia del ganglio statoacoustic sono stati osservati attraverso la colorazione tubulina acetilata. Il grado di innervazione del ganglio statoacoustic ha risentito, come gli embrioni che sono stati iniettati e elettroporate mostrano diminuzione ramificazione dei neuriti (Figura 5). Ci possono anche essere ridotta di condensazione delle cellule gangliari e / o riduzione del numero di cellule gangliari, perché la colorazione tubulina acetilata è significativamente diminuito negli embrioni che sono stati entrambi iniettato e elettroporate. Perché mif ha dimostrato di essere fondamentale per lo sviluppo del sistema nervoso (Suzuki et al., 2004), i cambiamenti osservati dopo l'elettroporazione può essere il risultato di trasfezione aumentato del MIF e mif-come MO soluzione nelle cellule neuroblasti.

Elettroporazione di oligo antisenso Morpholinos direttamente in un tessuto di sviluppo è uno strumento utile per controllare l'espressione di un gene durante lo sviluppo del tessuto che, sia spazialmente e temporalmente, nell'embrione. Elettroporazione di mif e mif-MOS, come nei tessuti dell'orecchio interno portato a morfologia anormale sia della macula posteriore e il ganglio statoacoustic. C'è stata una riduzione del numero delle cellule ciliate sensoriali nella macula posteriore negli embrioni che erano stati iniettati e elettroporate rispetto a embrioni che non aveva ricevuto alcun trattamento o con embrioni che erano stati o solo iniettata o solo elettroporate. C'era anche una diminuzione del grado di innervazione della patch posteriore sensoriali dal ganglio statoacoustic e la dimensione del SAG. L'elettroporazione è un metodo prezioso per trasfezione macromolecole nei tessuti specifici, con il vantaggio di osservare gli effetti primari di quel particolare DNA, l'RNA, o MO nel tessuto desiderato e discriminante da questi effetti secondari su altri tessuti, compreso il cervello, cresta neurale e mesenchima periotica sullo sviluppo dell'orecchio interno (Barald e Kelley, 2004).

Materiali

1. MOS: 0,3 mm di una combinazione di per MIF, mif-come MO1 e MO2 mif-come è stato utilizzato.
   Mif MO è gratuita per il codone di inizio di mRNA zebrafish mif: 5'-acatcggcatgactgcgacagagat-3 '. Due MOS sono stati utilizzati per mif-like mif-come MO1 è gratuita per il sito traslazionale inizio:. 5'-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 ', mentre mif-come MO2 derivato da AS sequenza al confine intron1/exon 2: 5'-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 '. Controllo MO era la sequenza nucleotidica strapazzate da Strumenti Gene: 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 '.
2. blu di metilene (0,3 ppm) in acqua i pesci
3. MS222 (tricaine, Sigma; 0,64 mm in acqua i pesci)
4. Basso punto di fusione agarosio (LMPA; Roche)
5. rosso fenolo (Sigma)
6. Anti-acetilato tubulina (Sigma)
7. Alexa Fluor ® 488 capra anti-topo secondo anticorpo (sonde molecolari)
8. Texas rosso-falloidina (sonde molecolari)