RNA interference è stato dimostrato molto efficace per analizzare la funzione del gene in Drosophila tracheale. Un protocollo dettagliato utilizzato da Jiang laboratorio di iniettare dsRNA in embrioni di volare a knockdown espressione genica è illustrato. Questa tecnica ha il potenziale per lo screening dei geni necessari per lo sviluppo di tessuti e organi in Drosophila.
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Articolo metodologico
L'interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Screening genetico è uno dei metodi più potenti disponibili per ottenere intuizioni complesso processo biologico 1. Nel corso degli anni molti miglioramenti e strumenti per la manipolazione genetica si sono resi disponibili in Drosophila 2. Subito dopo la scoperta iniziale Frie e Mello 3 che doppio filamento di RNA possono essere utilizzate per knockdown l'attività di singoli geni in Caenorhabditis elegans, è stato mostrato interferenza dell'RNA (RNAi) per fornire un potente approccio inverso genetico di analizzare le funzioni del gene nello sviluppo di Drosophila organo 4, 5.
Molti organi, compreso il polmone, rene, fegato e sistema vascolare, sono composti da tubolari ramificate reti di trasporto che i fluidi vitali o gas 6, 7. L'analisi della formazione di Drosophila tracheale fornisce un ottimo sistema modello per studiare la morfogenesi degli altri organi tubolari 8. The Berkeley Drosophila Genome Project ha rivelato centinaia di geni che si esprimono nel sistema tracheale. Per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della formazione del tubo, la sfida è comprendere il ruolo di questi geni nello sviluppo tracheale. Qui, abbiamo descritto un metodo dettagliato di dsRNA iniezione in embrione di Drosophila espressione genica knockdown individuali. Siamo riusciti abbattuto endogeno dysfusion (dis) espressione genica mediante iniezione dsRNA. Disfunzione è un bHLH-PAS proteina espressa nelle cellule fusione tracheali, ed è necessario per la fusione ramo tracheale 9, 10. disfunzione RNAi completamente eliminato espressione disfunzioni e ha portato in difetto di fusione tracheale. Questo metodo relativamente semplice fornisce uno strumento per identificare i geni requried per tissure e lo sviluppo degli organi in Drosophila.
Protocollo
1. Raccolta degli embrioni
- Impostare gabbie a 25 ° C con 2-4 giorni di età w 1118 piastre succo flies.Grape vengono cambiati ogni ora durante il giorno per sincronizzare la raccolta delle uova in 1-2 giorni prima del periodo di raccolta
- Raccogliere embrioni per 1 ora a 25 ° C
- Tagliare un pezzo rettangolare di agar succo d'uva, tagliate leggermente al centro con una lama di rasoio, lasciare una riga nel agar
- Utilizzare una sonda di metallo per il trasferimento degli embrioni da piastra succo d'uva al vostro pezzo di agar succo d'uva, li allineano in linea retta con l'asse più dell'embrione a 45 gradi con la linea in ....
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Discussione
L'attuale metodo di iniezione di dsRNA consente qui una analisi molto sensibile e rapida della funzione del gene nello sviluppo di Drosophila tracheale. Questo metodo può potenzialmente essere applicato per analizzare la funzione del gene per altri tessuti e lo sviluppo degli organi.
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Stefano per Crews dysfusion cDNA, anticorpi Dys e w le mosche 1118.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Olio alogenato 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Pompata picopompa Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micropipette | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
Riferimenti
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
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Ristampe e permessi
