Lievito Colony metodo di inserimento

Summary

Un metodo per l'integrazione di colonie di lievito che permette di sezionamento per la microscopia ottica ed elettronica. Questo protocollo consente di determinare la distribuzione delle cellule sporigeni e cellule pseudohyphal all'interno di colonie disposizione un nuovo strumento per comprendere l'organizzazione di tipi di cellule all'interno di una comunità fungine.

Abstract

Patterning di diversi tipi di cellule in embrioni è un meccanismo chiave dello sviluppo metazoi. Comunità di microrganismi, come colonie e biofilm anche visualizzare modelli di tipi di cellule. Per esempio, nel lievito S. cerevisiae, le cellule e le cellule pseudohyphal sporigeni non sono distribuite uniformemente in colonie. L'importanza funzionale di patterning e dei meccanismi molecolari che sono alla base di questi modelli sono ancora poco conosciuti.

Una sfida rispetto a indagare i modelli di tipi di cellule in colonie fungine è che a differenza dei tessuti metazoi, le cellule in colonie sono relativamente debolmente attaccati l'uno all'altro. In particolare, le colonie fungine non contengono lo stesso livello ampia di matrice extracellulare trovano nella maggior parte dei tessuti. Qui riportiamo un metodo per l'integrazione e sezionamento colonie di lievito che rivela i modelli interni di tipi di cellule in queste colonie. Il metodo può essere utilizzato per preparare sezioni spesse (0,5 μ) utile per la microscopia ottica e di sezioni sottili (0,1 μ) adatto per la microscopia elettronica a trasmissione. Cellule aschi e pseudohyphal può essere facilmente distinto da cellule di lievito ovoidale al microscopio ottico, mentre la struttura interna di queste cellule possono essere visualizzati da EM.

Il metodo si basa su colonie circostanti con agar, infiltrandosi con media Spurr, e poi sezionamento. Colonie con un diametro nel range di 1-2 mm sono adatte per questo protocollo. Oltre a visualizzare l'interno delle colonie, il metodo consente la visualizzazione della regione della colonia che invade l'agar sottostante.

Protocol

1. Colonia di isolamento e di fissaggio

1. Incubare 300 colonie su agar per il tempo indicato (una colonia isolata dovrebbe essere 1-2 mm di diametro).
2. Rimuovere colonia (faccia in su) e medie di fondo con una spatola stretta.
3. Mettere alcune gocce del 2% agar 42 ° C su un vetrino da microscopio utilizzando 1 ml Pipetman punta e subito colonia posto sul volto di agar prima si solidifica.
4. Mettere alcune gocce del 2% agar 42 ° C in colonia e lasciare solidificare.
5. Indossare guanti per tutte le fasi per il resto di questo protocollo
6. Blocco assetto con lama di rasoio e metterli in un mL 3,5 borosilicato con tappo a....

Discussion

Il metodo presentato rivela la struttura interna delle colonie. Poiché il metodo è efficace nel determinare i modelli di tipi di cellule in una gamma di S. ceppi di Saccharomyces con diverse morfologie di colonia, e anche in una specie legate S. paradoxus ^5, il metodo è anche probabile che il lavoro su una vasta gamma di funghi e altri microrganismi.

Un passo fondamentale per il successo del metodo è quello di garantire che l'intera colonia, compresa la parte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopia elettronica con tetrossido di osmio	Scienze	RT 19152
Stampi per inclusione in silicone	Fisher Scientific	NC 9975029
Resina epossidica cicloalifatica	Scienze di microscopia elettronica	RT 15004	ERL 4221
Resina epossidica	Microscopia elettronica Scienze	RT 13000	DER 736
Anidride	nonenilsuccinicaScienze della microscopia elettronica	RT 19050	NSA
2-dimetilammina– thanol	Microscopia elettronica Scienze	RT 13300	DMAE
Mezzi di montaggio	KPL Inc	71-00-16
Ruota rotante	Ted Pella, Inc.	Pelco 1055
Microtomo	Leica Microsystems	Ultracut S