In questo video, dimostriamo la visualizzazione di traslocazione della PKC nelle cellule viventi utilizzando PKCS fluorescente tag.
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Articolo metodologico
Live-imaging di traslocazione della PKC in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteina chinasi C (PKCS) sono serina treonina chinasi che svolgono un ruolo centrale nella regolazione una vasta gamma di processi cellulari, come la crescita cellulare e di apprendimento e memoria. Ci sono quattro famiglie note delle isoforme PKC nei vertebrati: PKCS classica (α, βI, βII e γ), nuovo tipo I PKCS (ε e η), romanzo di tipo II PKCS (δ e θ), e PKCS atipici (ζ e ι ). Il PKCS classici sono attivati dal Ca 2 + e diacylclycerol (DAG), mentre il PKCS romanzo sono attivati da DAG, ma sono Ca 2 +-indipendenti. Il PKCS atipici sono attivati né Ca 2 + né DAG. In Aplysia californica, il nostro sistema modello per studiare la formazione della memoria, ci sono tre isoforme specifiche del sistema nervoso PKC uno per ogni categoria principale, cioè la tradizionale PKC ho Apl, il tipo di romanzo che PKC Apl II e il III atipico PKC Apl. PKCS sono lipidi-chinasi attivate, e quindi l'attivazione di PKCS classico e romanzo in risposta a segnali extracellulari è stata spesso correlata con traslocazione della PKC dal citoplasma alla membrana plasmatica. Pertanto, visualizzando traslocazione della PKC in tempo reale in cellule vive è diventato uno strumento prezioso per chiarire le vie di trasduzione del segnale che portano all'attivazione della PKC. Per esempio, questa tecnica ha permesso di stabilire che diverse isoforme della PKC traslocare in condizioni diverse di mediare tipi distinti di plasticità sinaptica e che (5HT) l'attivazione della PKC serotonina Apl II richiede la produzione di entrambi i DAG e acido fosfatidico (PA) per traslocazione 1-2. Soprattutto, la capacità di visualizzare il neurone ripetutamente lo stesso ci ha permesso, ad esempio, per misurare desensibilizzazione della risposta PKC nei minimi dettagli 3. In questo video, dimostriamo ogni fase della preparazione SF9 colture cellulari, colture di neuroni sensoriali Aplysia sono stati descritti in un altro articolo video 4, esprimendo PKCS fluorescente taggato in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali e Aplysia live-imaging di traslocazione della PKC in risposta a attivatori diversi utilizzando la microscopia a scansione laser.
Protocollo
1. Preparazione e manutenzione di colture cellulari monostrato SF9
- SF9 coltura cellulare e la manutenzione viene eseguita in una cappa di coltura di tessuti.
- SF9 cellule derivano da cellule ovariche di Spodoptera frugiperda (Sf21 cellule) e può essere acquistato come cellule congelate nei mezzi di comunicazione di Grace da Invitrogen.
- Luogo 8 mL di medium insetti Grace, integrati (1X), per cui il 30% di siero fetale bovino (FBS) è stato aggiunto in un centimetro 75 2 fiasco coltura cellulare con un collo inclinato.
- Scongelare il tubo ghiacciato di SF9 cellule rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C il ....
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Discussione
Abbiamo descritto una tecnica per traslocazione immagine di PKCS fluorescente taggato in tempo reale in SF9 cellule e nei neuroni sensoriali Aplysia. SF9 cellule fornire un sistema semplice per traslocazione immagine PKC dal coltura e trasfezione loro è molto semplice in avanti. Al contrario, la microiniezione di neuroni sensoriali Aplysia vuole del tempo per padroneggiare, fino a pochi mesi. Difficoltà legate a questa tecnica comprendono l'intasamento degli elettrodi. Filtraggio della soluzione in.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Concessione di S. Wayne Sossin. Carole A. Farah è il destinatario di una borsa di studio post-dottorato dal Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e una borsa di studio Conrad Harrington. Gli autori desiderano ringraziare Joanna Bougie, Margaret Hastings e Margaret Labban aiuto per le riprese video e Madeline piscina Richmond per aiutare con la panoramica grafica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Cellule Sf9 congelate | Spodoptera frugiperda cellule ovariche | Invitrogen | B825-01 | |
| Grazia’Mezzo per insetti, integrato (1X), liquido | Reagente | GIBCO, di Life Technologies | 11605-094 | Utilizzare per coltivare cellule Sf9 |
| Corning 75 cm²2 fiasco per coltura cellulare con collo inclinato | Strumento | Corning | 430720 | Utilizzare per coltivare cellule Sf9 |
| Siero fetale bovino | Reagente | CanSera | CS-C08-500 | Supplementare Grace’s media con FBS prima dell'uso |
| Siringa | Strumento | BD Biosciences | 309604 | Usare per filtrare la soluzione di Verde Rapido |
| Siringa | Strumento | BD Biosciences | 309602 | Usare per filtrare la soluzione di DNA plasmidico / Fast Green |
| Filtrare | Strumento | Corning | 431229 | Usare per filtrare la soluzione di Verde Fast |
| Filtro | Strumento | Corning | 431212 | Usare per filtrare la soluzione di DNA plasmidico / Fast Green |
| Piatto con fondo in vetro | Strumento | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Utilizzare per coltivare cellule Sf9 prima della trasfezione e dell'analisi di imaging |
| Reagente Cellfectin II | Reagente | Invitrogen | 10362-100 | Utilizzato per esprimere PKC marcate con fluoroforo in cellule Sf9 |
| Fast Green FCF | Reagente | Sigma-Aldrich | F-7252 | Utilizzare per visualizzare la microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in Aplysia neuroni sensoriali |
| Capillari di vetro a parete sottile | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Utilizzare per preparare micr–Elettrodi per microiniezione |
| Punta di pipetta Microloader | Strumento | Eppendorf | CA32950-050 | Sterilizzare in autoclave prima dell'uso per riempire la micropipetta–Elettrodi per microiniezione |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Parte della stazione di microiniezione |
| Micr–portaelettrodo | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Utilizzare per tenere il micr–elettrodo |
| Micromanipolatore | Strumento | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Utilizzare per posizionare il micr–elettrodo nei tre assi |
Riferimenti
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein,
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Ristampe e permessi
