Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l'etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.
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Articolo metodologico
Con tutto il supporto per l'analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tutto-mount analisi immunoistochimica per l'imaging la vascolarizzazione intera è fondamentale per la comprensione dei meccanismi cellulari di ramificazione morfogenesi. Abbiamo sviluppato la pelle modello vascolarizzazione degli arti per lo studio dello sviluppo vascolare in cui viene riorganizzato un preesistente primitivo plesso capillare in una rete ramificata gerarchicamente vascolare. Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura più permette l'imaging con robusto dei vasi sanguigni intatti così come i loro componenti cellulari, comprese le cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce, utilizzando specifici marcatori fluorescenti. I progressi in questo modello vascolarizzazione della pelle degli arti con studi genetici hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari di sviluppo vascolare e patterning. La pelle modello vascolarizzazione degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici fornire un modello spaziale per la differenziazione ed il modello delle arterie. In questo articolo video descrive un protocollo semplice e robusto per colorare i vasi sanguigni intatti vascolare con anticorpi specifici e anticorpi secondari fluorescenti, che è applicabile per vascolarizzato organi embrionali dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare.
Protocollo
1. La raccolta degli arti pelle embrionali di topo (~ E13.5 E17.5)
- Euthanize collegato femmine con procedura approvata. Secondo il nostro protocollo animali approvati, le femmine sono eutanasia da CO 2 l'esposizione e poi assicurata dalla dislocazione cervicale. Giaceva l'animale al tovagliolo di carta assorbente e immergerlo completamente nel 70% EtOH / H 2 O da una bottiglia a spruzzo.
- Sezionare l'utero intatto e mettetelo in un piatto da 100 mm x 15 Petri contenenti soluzione equilibrata Salt ghiacciata Hanks '(HBSS) per lavare nel sangue.
- Separati e sezionare l'embrione. Rimuovere il amnios molto sottile dall'e....
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Discussione
Il sistema vascolare è fondamentale per lo sviluppo degli organi durante l'embriogenesi, nonché per la manutenzione degli organi e delle funzioni riproduttive negli adulti, in quanto fornisce sufficiente ossigeno e nutrienti agli organi. Adeguata rete vascolare è ben stabilita con processi complessi e multi-passo per l'angiogenesi in cui viene riorganizzato pre-esistente rete capillare di strutture fortemente ramificate e gerarchica. Sebbene numerose opere sono state dimostrato che una varietà di molecole è coin.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo K. Gill per l'assistenza con l'allevamento del mouse e cura e per la gestione del laboratorio. Grazie anche a Mukoyama membri laboratorio per assistenza tecnica. Il finanziamento è stato fornito dal programma di ricerca intramurale degli Istituti Naitonal della Salute.
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Materiali
Anticorpi
Pan-marker delle cellule endoteliali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
| PECAM-1 | Criceto armeno (M) | Chemicon | MAB1398Z | Diluizione 1:100 # 1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | Diluizione 1:300 |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | Diluizione 1:200 |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | Diluizione 1:300 |
| Collagene IV | Coniglio (P) | ABD Serotec | 2150-1470 | Diluizione 1:300 # 2 |
Arterioso marker delle cellule endoteliali
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| Neuropilin1 | Coniglio (P) | Laboratorio del Kolodkin Alex # 3 | Diluizione 1:3000 | |
| Unc5H2 | Capra (P) | R & S | AF1006 | Diluizione 1:200 |
Venoso marker delle cellule endoteliali
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| EphB4 | Capra (P) | R & S | AF446 | Diluizione 1:100 |
Linfatico marker delle cellule endoteliali
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| LYVE-1 # 4 | Coniglio (P) | Abcam | ab14917 | Diluizione 1:200 |
| LYVE-1 # 4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | Diluizione 1:200 |
| Prox-1 | Coniglio (P) | Chemicon | AB5475 | Diluizione 1:1000 |
| Prox-1 | Capra (P) | R & S | AF2727 | Diluizione 1:50 |
| Neuropilin2 | Coniglio (P) | Cell Signaling | 3366 | 1; 100 diluizione |
| Podoplanin | Criceto siriano (M) | Ibridomi Banca | 8.1.1 | Diluizione 1:200 |
Delle cellule muscolari lisce / periciti marcatore
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| αSMA-Cy3 | Mouse (M) # 5 | Sigma | c-6198 | Diluizione 1:500 # 6 |
| NG2 | Coniglio (P) | Chemicon | AB5320 | Diluizione 1:200 |
| SM22α | Coniglio (P) | Abcam | ab14106 | Diluizione 1:200 |
Anticorpi per giornalista GFP
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| GFP | Coniglio (P) | Invitrogen | A11122 | Diluizione 1:300 |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | Diluizione 1:1000 |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | Diluizione 1:300 |
Anticorpi per giornalista LacZ
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| β-gal | Coniglio (P) | MP Biomedica | 55976 | Diluizione 1:5000 |
| β-gal | Capra (P) | ABD Serotec | 4600-1409 | Diluizione 1:500 |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | Diluizione 1:200 |
Anticorpi per assoni periferici
| Anticorpo | Specie | Azienda | Catalogo # | Condizione di lavoro |
|---|---|---|---|---|
| 2H3 | Mouse (M) # 7 | Ibridomi Banca | 2H3 | Diluizione 1:200 |
| Tuj1 | Mouse (M) # 8 | Covance | MMS-435P | Diluizione 1:500 |
| Peripherin | Coniglio (P) | Chemicon | AB1530 | Diluizione 1:1000 |
Anticorpi per la migrazione di cellule di Schwann
| BFABP | Coniglio (P) | Il laboratorio di Thomas Müller # 9 | Diluizione 1:3000 |
|---|
(P): anticorpo policlonale, (M): anticorpo monoclonale
# 1: capra anti-armeno criceto-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) anticorpo deve essere usato come anticorpo secondario.
# 2: l'anticorpo collagene IV può essere utilizzato per rilevare i vasi sanguigni dopo ibridazione in situ.
# 3: L'anticorpo Neuropilin1 è gentilmente fornito da laboratorio del Kolodkin di Alex nella Johns Hopkins University. Pecora anti-umano degli anticorpi Neuropilin1 è disponibile in R & S (AF3870), anche se non l'abbiamo ancora testato.
# 4: Il LYVE-1 anticorpi anche rilevare un sottoinsieme dei macrofagi nella pelle embrionale.
# 5: L'anti-αSMA anticorpo monoclonale di topo IgG2a.
# 6: Il Cy3-anticorpo coniugato αSMA è incubato per 1 ora a temperatura ambiente insieme al secanticorpi secondaria per gli altri anticorpi primari.
# 7: 2H3 anticorpo è topo monoclonale IgG1 contro neurofilamenti.
# 8: Tuj1 anticorpo è topo IgG2a anticorpi monoclonali contro Neuron specifica classe III beta-tubulina.
# 9: (cervello-specifiche di acidi grassi legame con le proteine) BFABP anticorpo è gentilmente fornito da laboratorio del Müller Thomas in Max-Delbrück-Centro di Medicina Molecolare.
Riferimenti
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J.
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Ristampe e permessi
