Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

Sommario

Questo è un passo-passo guida che mostra la finalità, il funzionamento ei risultati rappresentante del spettrometro romanzo forza gravitazionale.

Abstract

Lo studio della struttura macromolecolare è diventato fondamentale per il chiarimento dei meccanismi molecolari e funzione. Ci sono diversi bioinstruments limitato, ma importante, in grado di testare la dipendenza forza delle caratteristiche strutturali di proteine. Scala è stata un parametro che limita la quantità accuratamente i ricercatori possono scrutare il mondo nanomeccaniche di molecole, come gli acidi nucleici, enzimi e proteine ​​motrici che eseguono sostiene la vita di lavoro. Microscopia a forza atomica (AFM) è ben sintonizzato per determinare le strutture native delle proteine ​​fibrose con una risoluzione distanza alla pari con microscopia elettronica. Tuttavia, in studi AFM vigore, le forze sono in genere molto più alto di una singola molecola che si verifichino ^{1, 2.} Trappole ottiche (OT) sono molto bravi a determinare la distanza relativa tra le perle intrappolati e possono impartire piccole forze ^3. Tuttavia, essi non producono accurata lunghezze assolute delle molecole oggetto di studio. Simulazione molecolare fornire informazioni di supporto a tali esperimenti, ma sono limitate nella capacità di gestire le stesse grandi dimensioni molecolari, tempi lunghi, e convincere alcuni ricercatori, in assenza di altre prove ^{2, 4.}

La forza gravitazionale spettrometro (GFS), riempie una nicchia critico nell'arsenale di un investigatore, fornendo una combinazione unica di capacità. Questo strumento è in grado di generare forze di solito con il 98% o maggiore precisione della gamma femtonewton alla gamma nanonewton. Le misure di distanza attualmente sono in grado di risolvere la lunghezza assoluta molecolare fino a cinque nanometri, e relative distanze di perline paio di separazione con una precisione simile a una trappola ottica. Inoltre, il GFS può determinare stretching o srotolare in cui la forza è vicino all'equilibrio o fornire una forza graduata a giustapporre contro qualsiasi cambiamento strutturale misurata. E 'anche possibile determinare il numero di residui di aminoacidi sono coinvolti in eventi di srotolare sotto carichi fisiologici forza ^2. A differenza di altri metodi dove si trova la forza di calibrazione estesa che deve precedere qualsiasi test, il GFS non richiede alcuna calibrazione tale forza ^5. Integrando i punti di forza di altri metodi, il GFS colmerà le lacune nella comprensione dei nanomeccanica delle proteine ​​vitali e di altre macromolecole.

Protocollo

Introduzione alla configurazione di GFS Novel

La GFS è costituito da diversi componenti essenziali: un microscopio ottico normale, una montatura equatoriale, una telecamera e un computer [Figura 1]. La tenuta del flusso delle cellule da camera che contiene il campione è anche indispensabile secondo il disegno GFS. Il microscopio a luce è montato sulla montatura equatoriale in modo che il campo può essere ruotato in diversi orientamenti nello spazio. Questa capacità consente al vettore di gravità statica da sfruttare in modo che i campioni possono essere dinamicamente orientato in relazione al vettore così la forza di gravità può dare picone....

Discussione

Durante la conversione di un filmato a una rappresentazione digitale thresholded, è fondamentale per l'immagine thresholded a mantenere la stessa area in ogni fotogramma del video. Perché le perle di una coppia cordone si muovono indipendentemente l'uno dall'altro, la sua deriva nelle aree thresholded può anche causare le distanze relative tra i centroidi delle perline alla deriva e introdurre errori significativi. Il controllo della zona ha ridotto la soglia di errore di cinque volte nelle misure da 26 nm d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3-Aminopropiltriethoxisilano	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Piridina	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldeide	Fisher Scientific	G7776
Glicina	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Azoturo di sodio	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulosa	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimetilformammide	Estratto da Large New	D4254
Miosina scheletrica da coniglio II	Conigli bianchi della Nuova Zelanda (7-8)	NA
Anticorpo MF30 (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
Anticorpo MF20 (6)	Hybridoma Bank	MF20
Microscopio da laboratorio	Boreal	WW57905M00
Montatura equatoriale	Celestron	CG-5
Telecamera video digitale	Sony Corporation	XCDV60
Sistema di rilascio a calibro	Cabelas	IA-415482
Molla di compressione	Jones Spring Co.	723
Molla di estensione	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Piloti e applicazione Fire-i &	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA