Passaging cellule staminali neuronali

Summary

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Abstract

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).

Protocol

Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base.

Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle

1. Per preparare nuovi palloni per le cellule diversi passaggi, cappotto fiasche T25 con 10 mg / ml fibronectina umana in Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. Poco prima passaging le cellule, rimuovere la soluzio....

Discussion

Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è import.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, insulina, transferrina)	Reagente	Stem Cell Technologies	09500
Reagente antibiotico-antimicotico		Invitrogen	15240-062
DMEM:F12 (1X)	Reagente	Invitrogen	11330-032
EMEM (1X)	Reagente	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distribuito da Fisher con il catalogo indicato #
Reagente siero bovino fetale		Invitrogen	10437-028
FGF, reagente ricombinante basico umano		PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reagente	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, reagente ricombinante umano		BD Biosciences	CB40052	Distribuito da Fisher con il catalogo indicato #
Cell Culture Flask, 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	Distribuito da Fisher con il catalogo indicato #
Fibronectina, umana, naturale	Reagente	BD Biosciences	CB40008A	Distribuito da Fisher con il catalogo indicato #
Human Neural Stem/Precursor	Cells	National Human Neural Stem Cell Resource National Human Neural Stem Cell Resource
reagente	tampone per dissociazione cellulare	Invitrogen	13150-016