Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Sommario

Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Abstract

Western Blotting (o immunoblotting) è una procedura standard di laboratorio che consente agli investigatori di verificare l'espressione di una proteina, determinare la quantità relativa delle proteine ​​presenti in diversi campioni, e analizzare i risultati di esperimenti di co-immunoprecipitazione. In questo metodo, una proteina bersaglio viene rilevata con un anticorpo primario specifico in un dato campione di tessuto omogenato o estratto. Separazione delle proteine ​​in base al peso molecolare è realizzato utilizzando denaturazione SDS-PAGE. Dopo il trasferimento di una membrana, la proteina bersaglio è sondato con uno specifico anticorpo primario e rilevati da chemiluminescenza.

Fin dalla sua prima descrizione, la tecnica Western-blotting ha subito diversi miglioramenti, tra cui prefabbricati gel e di facile utilizzo dell'apparecchiatura. Nel nostro laboratorio, abbiamo scelto di utilizzare il commercio sistema di elettroforesi NuPAGE da Invitrogen. Si tratta di un innovativo pH neutro, discontinuo SDS-PAGE, prefabbricati mini-gel sistema. Questo sistema presenta diversi vantaggi rispetto alla tecnica tradizionale Laemmli tra cui: i) una maggiore durata di conservazione dei prefabbricati gel che vanno da 8 mesi a 1 anno, ii) una vasta gamma di separazione pesi molecolari 1-400 kDa a seconda del tipo di gel utilizzati, e iii) una maggiore versatilità (intervallo di percentuale di acrilamide, il tipo di gel, e la composizione ionica del tampone di corsa).

La procedura descritta in questo articolo il video utilizza il Bis-Tris sistema discontinuo buffer con 4-12% Bis-Tris gradiente di gel e MES esecuzione tampone, come illustrazione di come eseguire un western-blot utilizzando il sistema NuPAGE Invitrogen elettroforesi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottenuto buoni risultati e riproducibili per varie applicazioni biochimiche con questo metodo western blotting.

Protocollo

Gel elettroforesi

Nota tecnica: Prima di iniziare la procedura, i vostri campioni di proteine ​​pronto.

Durante questa prima fase, le proteine ​​nel campione sono separati in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide (PAG). Il NuPAGE ® Sample Buffer LDS caricato con solfato di litio Dodecyl (LDS) mantiene in uno stato di polipeptidi denaturati una volta il campione è stato riscaldato a 70 ° C per 10 minuti. Un forte agente riducente viene utilizzato in combinazione per rimuovere la struttura secondaria e terziaria ....

Discussione

La procedura qui presentata usa un gel Bis-Tris con MES esecuzione buffer come un esempio di denaturazione PAGINA utilizzando il sistema di elettroforesi Invitrogen NuPAGE Novex. Inoltre, questo pre-cast sistema gel permette la separazione delle proteine ​​in denaturazione o non denaturazione condizioni e ospita una vasta gamma di pesi molecolari (1-200 kDa per il gel Bis-Tris di 36-400 kDa per la Tris- gel acetato). A seconda del vostro esperimento, si può scegliere di seguire solo una parte della tecnica di western blotting qui descritte .......